സസ്യ മൈക്രോട്യൂബുലുകളെ ബാധിക്കുന്ന സസ്യ വളർച്ചാ ഇൻഹിബിറ്ററുകളായി ഉർസ മോണോമൈഡുകളുടെ കണ്ടെത്തലും സ്വഭാവവും പ്രവർത്തനപരമായ മെച്ചപ്പെടുത്തലും.

Nature.com സന്ദർശിച്ചതിന് നന്ദി.നിങ്ങൾ ഉപയോഗിക്കുന്ന ബ്രൗസറിൻ്റെ പതിപ്പിന് പരിമിതമായ CSS പിന്തുണയുണ്ട്.മികച്ച ഫലങ്ങൾക്കായി, നിങ്ങളുടെ ബ്രൗസറിൻ്റെ ഏറ്റവും പുതിയ പതിപ്പ് ഉപയോഗിക്കാൻ ഞങ്ങൾ ശുപാർശ ചെയ്യുന്നു (അല്ലെങ്കിൽ Internet Explorer-ൽ അനുയോജ്യത മോഡ് പ്രവർത്തനരഹിതമാക്കുക).അതിനിടയിൽ, നിലവിലുള്ള പിന്തുണ ഉറപ്പാക്കാൻ, ഞങ്ങൾ സ്റ്റൈലിംഗോ JavaScript ഇല്ലാതെ സൈറ്റ് കാണിക്കുന്നു.
പ്രകൃതിദത്ത ഉൽപ്പന്നങ്ങളുടെ കണ്ടെത്തലും പ്രയോജനകരമായ ഉപയോഗവും മനുഷ്യജീവിതം മെച്ചപ്പെടുത്താൻ സഹായിക്കും.കളകളെ നിയന്ത്രിക്കാൻ സസ്യവളർച്ച തടയുന്ന രാസവസ്തുക്കൾ കളനാശിനികളായി വ്യാപകമായി ഉപയോഗിക്കുന്നു.വ്യത്യസ്ത തരം കളനാശിനികൾ ഉപയോഗിക്കേണ്ടതിൻ്റെ ആവശ്യകത കാരണം, പ്രവർത്തനത്തിൻ്റെ പുതിയ സംവിധാനങ്ങളുള്ള സംയുക്തങ്ങൾ തിരിച്ചറിയേണ്ടത് ആവശ്യമാണ്.ഈ പഠനത്തിൽ, സ്ട്രെപ്റ്റോമൈസസ് വെറേൻസിസ് MK493-CF1-ൽ നിന്ന് ഞങ്ങൾ N-alkoxypyrrole സംയുക്തം, coumamonamide എന്ന നോവൽ കണ്ടെത്തുകയും സമ്പൂർണ്ണ സമന്വയ പ്രക്രിയ സ്ഥാപിക്കുകയും ചെയ്തു.ബയോളജിക്കൽ ആക്ടിവിറ്റി അസെസ് വഴി, urs-monoamic ആസിഡ് urs-monoamide-ൻ്റെ ഒരു സിന്തറ്റിക് ഇൻ്റർമീഡിയറ്റാണെന്നും ഒരു സാധ്യതയാണെന്നും ഞങ്ങൾ കണ്ടെത്തി.സസ്യവളർച്ച തടയൽ.കൂടാതെ, ഹെല കോശങ്ങളുടെ വളർച്ചയെ പ്രതികൂലമായി ബാധിക്കാതെ ഉയർന്ന കളനാശിനി പ്രവർത്തനമുള്ള ഉർബെനൈലോക്സി ഡെറിവേറ്റീവ് (യുഡിഎ) ഉൾപ്പെടെ വിവിധ അർബെനോണിക് ആസിഡ് ഡെറിവേറ്റീവുകൾ ഞങ്ങൾ വികസിപ്പിച്ചെടുത്തിട്ടുണ്ട്.ഉർമോട്ടോണിക് ആസിഡ് ഡെറിവേറ്റീവുകൾ പ്ലാൻ്റ് മൈക്രോട്യൂബുളുകളെ തടസ്സപ്പെടുത്തുന്നുവെന്നും ഞങ്ങൾ കണ്ടെത്തി;കൂടാതെ, KAND ആക്റ്റിൻ ഫിലമെൻ്റുകളെ ബാധിക്കുകയും കോശ മരണത്തിന് പ്രേരിപ്പിക്കുകയും ചെയ്യുന്നു;ഈ ബഹുമുഖ ഇഫക്റ്റുകൾ അറിയപ്പെടുന്ന മൈക്രോട്യൂബ്യൂൾ ഇൻഹിബിറ്ററുകളിൽ നിന്ന് വ്യത്യസ്തമാണ്, കൂടാതെ പുതിയ കളനാശിനികളുടെ വികസനത്തിൽ ഒരു പ്രധാന നേട്ടത്തെ പ്രതിനിധീകരിക്കുന്ന ഉർസോണിക് ആസിഡിൻ്റെ പ്രവർത്തനത്തിൻ്റെ ഒരു പുതിയ സംവിധാനം നിർദ്ദേശിക്കുന്നു.
പ്രയോജനപ്രദമായ പ്രകൃതിദത്ത ഉൽപ്പന്നങ്ങളുടെയും അവയുടെ ഡെറിവേറ്റീവുകളുടെയും കണ്ടെത്തലും പ്രായോഗിക പ്രയോഗവും മനുഷ്യജീവിതത്തിൻ്റെ ഗുണനിലവാരം മെച്ചപ്പെടുത്തുന്നതിനുള്ള ഒരു മാർഗമാണ്.സൂക്ഷ്മാണുക്കൾ, സസ്യങ്ങൾ, പ്രാണികൾ എന്നിവ ഉൽപ്പാദിപ്പിക്കുന്ന ദ്വിതീയ ഉപാപചയ പ്രവർത്തനങ്ങൾ വൈദ്യശാസ്ത്രത്തിലും കാർഷിക മേഖലയിലും വലിയ പുരോഗതിക്ക് കാരണമായി.പ്രകൃതിദത്ത ഉൽപ്പന്നങ്ങളിൽ നിന്ന് ധാരാളം ആൻറിബയോട്ടിക്കുകളും രക്താർബുദ വിരുദ്ധ മരുന്നുകളും വികസിപ്പിച്ചെടുത്തിട്ടുണ്ട്.കൂടാതെ, വിവിധ തരംകീടനാശിനികൾ, കൃഷിയിൽ ഉപയോഗിക്കുന്നതിനായി ഈ പ്രകൃതിദത്ത ഉൽപ്പന്നങ്ങളിൽ നിന്ന് കുമിൾനാശിനികളും കളനാശിനികളും വേർതിരിച്ചെടുക്കുന്നു.പ്രത്യേകിച്ച്, കളനിയന്ത്രണ കളനാശിനികൾ ആധുനിക കൃഷിയിൽ വിളവ് വർദ്ധിപ്പിക്കുന്നതിനുള്ള പ്രധാന ഉപകരണങ്ങളാണ്, കൂടാതെ വിവിധ തരത്തിലുള്ള സംയുക്തങ്ങൾ ഇതിനകം വാണിജ്യപരമായി ഉപയോഗിക്കുന്നു.ഫോട്ടോസിന്തസിസ്, അമിനോ ആസിഡ് മെറ്റബോളിസം, സെൽ വാൾ സിന്തസിസ്, മൈറ്റോസിസിൻ്റെ നിയന്ത്രണം, ഫൈറ്റോഹോർമോൺ സിഗ്നലിംഗ് അല്ലെങ്കിൽ പ്രോട്ടീൻ സിന്തസിസ് തുടങ്ങിയ സസ്യങ്ങളിലെ നിരവധി സെല്ലുലാർ പ്രക്രിയകൾ കളനാശിനികളുടെ സാധാരണ ലക്ഷ്യങ്ങളായി കണക്കാക്കപ്പെടുന്നു.മൈറ്റോട്ടിക് നിയന്ത്രണത്തെ ബാധിക്കുന്നതിലൂടെ സസ്യവളർച്ചയെ ബാധിക്കുന്ന കളനാശിനികളുടെ ഒരു സാധാരണ വിഭാഗമാണ് മൈക്രോട്യൂബ്യൂൾ പ്രവർത്തനത്തെ തടയുന്ന സംയുക്തങ്ങൾ.
മൈക്രോട്യൂബ്യൂളുകൾ സൈറ്റോസ്‌കെലിറ്റണിൻ്റെ ഘടകങ്ങളാണ്, അവ യൂക്കറിയോട്ടിക് സെല്ലുകളിൽ വ്യാപകമായി സംരക്ഷിക്കപ്പെടുന്നു.ട്യൂബുലിൻ ഹെറ്ററോഡൈമറിൽ α-ട്യൂബുലിൻ, β-ട്യൂബുലിൻ എന്നിവ അടങ്ങിയിരിക്കുന്നു, 13 പ്രോട്ടോഫിലമെൻ്റുകൾ ഒരു സിലിണ്ടർ ഘടന ഉണ്ടാക്കുന്നു.കോശങ്ങളുടെ ആകൃതി, കോശ വിഭജനം, ഇൻട്രാ സെല്ലുലാർ ട്രാൻസ്പോർട്ട് എന്നിവ ഉൾപ്പെടെ സസ്യകോശങ്ങളിൽ മൈക്രോട്യൂബ്യൂളുകൾ ഒന്നിലധികം പങ്ക് വഹിക്കുന്നു.പ്ലാൻ്റ് സെല്ലുകളിൽ ഇൻ്റർഫേസ് പ്ലാസ്മ മെംബ്രണിനു താഴെയുള്ള മൈക്രോട്യൂബുളുകൾ അടങ്ങിയിരിക്കുന്നു, കൂടാതെ ഈ കോർട്ടിക്കൽ മൈക്രോട്യൂബ്യൂളുകൾ സെല്ലുലോസ് സിന്തേസ് കോംപ്ലക്സുകളുടെ നിയന്ത്രണത്തിലൂടെ സെല്ലുലോസ് മൈക്രോ ഫൈബ്രിലുകളുടെ ഓർഗനൈസേഷനെ നിയന്ത്രിക്കുമെന്ന് കരുതപ്പെടുന്നു.റൂട്ട് എപ്പിഡെർമൽ സെല്ലുകളുടെ കോർട്ടിക്കൽ മൈക്രോട്യൂബ്യൂളുകൾ, റൂട്ട് ടിപ്പിൻ്റെ ദ്രുതഗതിയിലുള്ള നീളമേറിയ മേഖലയിൽ സ്ഥിതിചെയ്യുന്നു, കൂടാതെ സെല്ലുലോസ് മൈക്രോ ഫൈബറുകൾ ഈ മൈക്രോട്യൂബുലുകളെ പിന്തുടരുകയും സെൽ വികാസത്തിൻ്റെ ദിശ പരിമിതപ്പെടുത്തുകയും അതുവഴി അനിസോട്രോപിക് സെൽ നീളം വർദ്ധിപ്പിക്കുകയും ചെയ്യുന്നു.അതിനാൽ, മൈക്രോട്യൂബ്യൂൾ പ്രവർത്തനം സസ്യങ്ങളുടെ രൂപഘടനയുമായി അടുത്ത ബന്ധപ്പെട്ടിരിക്കുന്നു.ട്യൂബുലിൻ എൻകോഡ് ചെയ്യുന്ന ജീനുകളിലെ അമിനോ ആസിഡിൻ്റെ പകരക്കാർ കോർട്ടിക്കൽ മൈക്രോട്യൂബ് അറേകളുടെ വ്യതിയാനത്തിനും അറബിഡോപ്സിസ് 6,7-ൽ ഇടത് അല്ലെങ്കിൽ വലത് വശത്തുള്ള വളർച്ചയ്ക്കും കാരണമാകുന്നു.അതുപോലെ, മൈക്രോട്യൂബ്യൂൾ ഡൈനാമിക്സിനെ നിയന്ത്രിക്കുന്ന മൈക്രോട്യൂബ്-അസോസിയേറ്റഡ് പ്രോട്ടീനുകളിലെ മ്യൂട്ടേഷനുകളും റൂട്ട് വളർച്ചയുടെ വികലമായ വളർച്ചയ്ക്ക് കാരണമാകും.കൂടാതെ, പ്രീറ്റിലാക്ലോർ എന്നറിയപ്പെടുന്ന ഡിസോപൈറാമൈഡ് പോലുള്ള മൈക്രോട്യൂബ്യൂൾ തടസ്സപ്പെടുത്തുന്ന കളനാശിനികൾ ഉപയോഗിച്ചുള്ള ചികിത്സയും ഇടത് വശത്തുള്ള ചരിഞ്ഞ വേരുകളുടെ വളർച്ചയ്ക്ക് കാരണമാകുന്നു.ചെടികളുടെ വളർച്ചയുടെ ദിശ നിർണ്ണയിക്കുന്നതിന് മൈക്രോട്യൂബ്യൂൾ ഫംഗ്‌ഷൻ്റെ കൃത്യമായ നിയന്ത്രണം നിർണായകമാണെന്ന് ഈ ഡാറ്റ സൂചിപ്പിക്കുന്നു.
വിവിധ തരത്തിലുള്ള മൈക്രോട്യൂബ്യൂൾ ഇൻഹിബിറ്ററുകൾ കണ്ടെത്തിയിട്ടുണ്ട്, കൂടാതെ ഈ മരുന്നുകൾ സൈറ്റോസ്‌കെലെറ്റൽ ഗവേഷണത്തിലും കൃഷിയിലും വൈദ്യശാസ്ത്രത്തിലും കാര്യമായ സംഭാവനകൾ നൽകിയിട്ടുണ്ട്2.പ്രത്യേകിച്ചും, ഒറിസാലിൻ, ഡൈനിട്രോഅനിലിൻ സംയുക്തങ്ങൾ, ഡിസോപിറാമൈഡ്, ബെൻസമൈഡുമായി ബന്ധപ്പെട്ട സംയുക്തങ്ങൾ, അവയുടെ അനലോഗ് എന്നിവയ്ക്ക് മൈക്രോട്യൂബ്യൂളിൻ്റെ പ്രവർത്തനത്തെ തടയാനും അതുവഴി സസ്യവളർച്ച തടയാനും കഴിയും.അതിനാൽ, അവ വ്യാപകമായി കളനാശിനികളായി ഉപയോഗിക്കുന്നു.എന്നിരുന്നാലും, മൈക്രോട്യൂബ്യൂളുകൾ സസ്യങ്ങളുടെയും മൃഗങ്ങളുടെയും കോശങ്ങളിലെ ഒരു പ്രധാന ഘടകമായതിനാൽ, മിക്ക മൈക്രോട്യൂബ്യൂൾ ഇൻഹിബിറ്ററുകളും രണ്ട് കോശ തരങ്ങൾക്കും സൈറ്റോടോക്സിക് ആണ്.അതിനാൽ, കളനാശിനികളായി അവയുടെ അംഗീകൃത യൂട്ടിലിറ്റി ഉണ്ടായിരുന്നിട്ടും, പ്രായോഗിക ആവശ്യങ്ങൾക്കായി പരിമിതമായ ആൻ്റിമൈക്രോട്യൂബ്യൂൾ ഏജൻ്റുകൾ ഉപയോഗിക്കുന്നു.
സ്ട്രെപ്റ്റോമൈസസ് കുടുംബത്തിലെ ഒരു ജനുസ്സാണ് സ്ട്രെപ്റ്റോമൈസസ്, അതിൽ എയ്റോബിക്, ഗ്രാം പോസിറ്റീവ്, ഫിലമെൻ്റസ് ബാക്ടീരിയകൾ ഉൾപ്പെടുന്നു, കൂടാതെ ദ്വിതീയ മെറ്റബോളിറ്റുകളുടെ വിശാലമായ ശ്രേണി ഉൽപ്പാദിപ്പിക്കാനുള്ള കഴിവിന് പരക്കെ അറിയപ്പെടുന്നു.അതിനാൽ, പുതിയ ജൈവശാസ്ത്രപരമായി സജീവമായ പ്രകൃതി ഉൽപ്പന്നങ്ങളുടെ ഏറ്റവും പ്രധാനപ്പെട്ട സ്രോതസ്സുകളിലൊന്നായി ഇത് കണക്കാക്കപ്പെടുന്നു.നിലവിലെ പഠനത്തിൽ, സ്ട്രെപ്റ്റോമൈസസ് വെറേൻസിസ് MK493-CF1, S. Weraensis ISP 5486 എന്നിവയിൽ നിന്ന് വേർതിരിച്ചെടുത്ത coumamonamide എന്ന പുതിയ സംയുക്തം ഞങ്ങൾ കണ്ടെത്തി. സ്പെക്ട്രൽ വിശകലനവും പൂർണ്ണ സ്പെക്ട്രൽ വിശകലനവും ഉപയോഗിച്ച് coumamonamide-ൻ്റെ ഘടനയും അതിൻ്റെ അതുല്യമായ N-alkoxyelepyrr. നിശ്ചയിച്ചിരുന്നു.സിന്തസിസ്.ഉർസ്‌മോനോമൈഡിൻ്റെയും അതിൻ്റെ ഡെറിവേറ്റീവുകളുടെയും സിന്തറ്റിക് ഇൻ്റർമീഡിയറ്റായ ഉർസ്‌മോണിക് ആസിഡ്, ജനപ്രിയ മാതൃകാ സസ്യമായ അറബിഡോപ്സിസ് താലിയാനയുടെ വളർച്ചയെയും മുളയ്ക്കുന്നതിനെയും തടയുന്നതായി കണ്ടെത്തി.ഒരു ഘടന-പ്രവർത്തന ബന്ധ പഠനത്തിൽ, ഉർസോണിക് ആസിഡിൻ്റെ (KAND) നോണിലോക്സി ഡെറിവേറ്റീവ് എന്ന് വിളിക്കപ്പെടുന്ന, C9 ഉള്ള ഒരു സംയുക്തം ഉർസോണിക് ആസിഡിലേക്ക് പരിഷ്കരിച്ചത്, വളർച്ചയിലും മുളയ്ക്കുന്നതിലും തടസ്സപ്പെടുത്തുന്ന പ്രഭാവം ഗണ്യമായി വർദ്ധിപ്പിക്കുന്നതായി ഞങ്ങൾ കണ്ടെത്തി.പുതുതായി കണ്ടെത്തിയ സസ്യവളർച്ച ഇൻഹിബിറ്റർ പുകയിലയുടെയും ലിവർവോർട്ടിൻ്റെയും വളർച്ചയെയും ബാധിച്ചു, ഇത് ബാക്ടീരിയകളിലേക്കോ ഹെല കോശങ്ങളിലേക്കോ സൈറ്റോടോക്സിക് ആയിരുന്നില്ല എന്നത് ശ്രദ്ധേയമാണ്.കൂടാതെ, ചില ഉർമോട്ടോണിക് ആസിഡ് ഡെറിവേറ്റീവുകൾ ഒരു വികലമായ റൂട്ട് ഫിനോടൈപ്പിനെ പ്രേരിപ്പിക്കുന്നു, ഈ ഡെറിവേറ്റീവുകൾ നേരിട്ടോ അല്ലാതെയോ മൈക്രോട്യൂബുളുകളെ ബാധിക്കുന്നുവെന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു.ഈ ആശയത്തിന് അനുസൃതമായി, ഇമ്യൂണോഹിസ്റ്റോകെമിക്കലി അല്ലെങ്കിൽ ഫ്ലൂറസെൻ്റ് പ്രോട്ടീനുകൾ ഉപയോഗിച്ച് ലേബൽ ചെയ്തിരിക്കുന്ന മൈക്രോട്യൂബുലുകളെക്കുറിച്ചുള്ള ഞങ്ങളുടെ നിരീക്ഷണങ്ങൾ സൂചിപ്പിക്കുന്നത് KAND ചികിത്സ മൈക്രോട്യൂബുളുകളെ ഡിപോളിമറൈസ് ചെയ്യുന്നു എന്നാണ്.കൂടാതെ, കുമാമോട്ടോണിക് ആസിഡ് ഡെറിവേറ്റീവുകളുമായുള്ള ചികിത്സ ആക്ടിൻ മൈക്രോഫിലമെൻ്റുകളെ തടസ്സപ്പെടുത്തി.അങ്ങനെ, ഞങ്ങൾ ഒരു പുതിയ സസ്യവളർച്ച ഇൻഹിബിറ്റർ കണ്ടെത്തി, അതിൻ്റെ സവിശേഷമായ പ്രവർത്തനരീതി സൈറ്റോസ്‌കെലിറ്റണിൻ്റെ നാശം ഉൾക്കൊള്ളുന്നു.
സ്ട്രെയിൻ MK493-CF1 ടോക്കിയോയിലെ ഷിനഗാവ-കുവിൽ മണ്ണിൽ നിന്ന് വേർതിരിച്ചു.സ്ട്രെയിൻ MK493-CF1 നന്നായി ശാഖിതമായ സ്ട്രോമൽ മൈസീലിയം രൂപീകരിച്ചു.16S റൈബോസോമൽ RNA ജീനിൻ്റെ (1422 bp) ഭാഗിക ക്രമം നിർണ്ണയിക്കപ്പെട്ടു.ഈ സ്‌ട്രെയിന് S. വെറേൻസിസുമായി വളരെ സാമ്യമുള്ളതാണ് (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: സാധാരണ സ്‌ട്രെയിൻ, 99.93%).ഈ ഫലത്തെ അടിസ്ഥാനമാക്കി, ഈ സ്‌ട്രെയിന് എസ്. വെറേൻസിസിൻ്റെ തരം സ്‌ട്രെയിനുമായി അടുത്ത ബന്ധമുണ്ടെന്ന് നിർണ്ണയിക്കപ്പെട്ടു.അതിനാൽ, ഞങ്ങൾ ഈ സ്‌ട്രെയിനിന് താൽക്കാലികമായി S. werraensis MK493-CF1 എന്ന് പേരിട്ടു.S. werraensis ISP 5486T യും ഇതേ ബയോആക്ടീവ് സംയുക്തങ്ങൾ ഉത്പാദിപ്പിക്കുന്നു.ഈ സൂക്ഷ്മാണുക്കളിൽ നിന്ന് പ്രകൃതിദത്ത ഉൽപന്നങ്ങൾ ലഭിക്കുന്നതിന് ആദ്യകാല ഗവേഷണങ്ങൾ കുറവായതിനാൽ, കൂടുതൽ രാസ ഗവേഷണം നടത്തി.14 ദിവസത്തേക്ക് 30 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ സോളിഡ്-സ്റ്റേറ്റ് അഴുകൽ വഴി ബാർലി മീഡിയത്തിൽ S. werraensis MK493-CF1 കൃഷി ചെയ്ത ശേഷം, മീഡിയം 50% EtOH ഉപയോഗിച്ച് വേർതിരിച്ചെടുത്തു.59.5 മില്ലിഗ്രാം ക്രൂഡ് എക്സ്ട്രാക്റ്റ് ലഭിക്കാൻ 60 മില്ലി സാമ്പിൾ ഉണക്കി.N-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxamide (1, coumamonamide, 36.0 mg) നൽകാൻ ക്രൂഡ് എക്സ്ട്രാക്റ്റ് റിവേഴ്സ് ഫേസ് എച്ച്പിഎൽസിക്ക് വിധേയമാക്കി.1 ൻ്റെ മൊത്തം തുക ക്രൂഡ് എക്സ്ട്രാക്റ്റിൻ്റെ ഏകദേശം 60% ആണ്.അതിനാൽ, കുമാമോട്ടോമൈഡ് 1 ൻ്റെ ഗുണങ്ങൾ വിശദമായി പഠിക്കാൻ ഞങ്ങൾ തീരുമാനിച്ചു.
Coumamonamide 1 ഒരു വെളുത്ത രൂപരഹിതമായ പൊടിയാണ്, ഉയർന്ന റെസലൂഷൻ മാസ് സ്പെക്ട്രോമെട്രി (HRESIMS) C6H8N2O2 (ചിത്രം 1) സ്ഥിരീകരിക്കുന്നു.ഈ സംയുക്തത്തിൻ്റെ C2-പകരം പൈറോൾ ശകലം δH 6.94 (1H, t, J = 2.8, 4.8 Hz, H-4), δH 6.78 (1H, d, J = 2.5, δH 1H NMR5 Hzz: 4. , H-5), δH 6.78 (1H, d, J = 2.5 Hz, H-6), കൂടാതെ 13C NMR സ്പെക്ട്രം നാല് sp2 കാർബൺ ആറ്റങ്ങളുടെ സാന്നിധ്യം കാണിക്കുന്നു.C2 സ്ഥാനത്ത് ഒരു അമൈഡ് ഗ്രൂപ്പിൻ്റെ സാന്നിധ്യം C-3 പ്രോട്ടോണിൽ നിന്ന് δC 161.1-ൽ അമൈഡ് കാർബണിൽ കാർബണിലേക്കുള്ള HMBC പരസ്പരബന്ധം വിലയിരുത്തി.കൂടാതെ, δH 4.10 (3H, S), δC 68.3 എന്നിവയിലെ 1 H, 13 C NMR കൊടുമുടികൾ തന്മാത്രയിലെ N-methoxy ഗ്രൂപ്പുകളുടെ സാന്നിധ്യം സൂചിപ്പിക്കുന്നു.മെച്ചപ്പെടുത്തിയ വ്യത്യാസ സ്പെക്ട്രോസ്കോപ്പി, ന്യൂക്ലിയർ ഓവർഹോസർ ചുരുക്കെഴുത്ത് (NOEDF) പോലുള്ള സ്പെക്ട്രോസ്കോപ്പിക് വിശകലനം ഉപയോഗിച്ച് മെത്തോക്സി ഗ്രൂപ്പിൻ്റെ ശരിയായ സ്ഥാനം ഇതുവരെ നിർണ്ണയിച്ചിട്ടില്ലെങ്കിലും, N-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxamide ആദ്യത്തെ കാൻഡിഡേറ്റ് സംയുക്തമായി മാറി.
1 ൻ്റെ ശരിയായ ഘടന നിർണ്ണയിക്കാൻ, മൊത്തം സിന്തസിസ് നടത്തി (ചിത്രം 2a).വാണിജ്യപരമായി ലഭ്യമായ 2-അമിനോപൈരിഡിൻ 2-ൻ്റെ m-CPBA യുടെ ചികിത്സ, അളവ് വിളവിൽ അനുബന്ധ N-ഓക്സൈഡ് 3-ന് കാരണമായി.2-ൻ്റെ 2-അമിനോഅസിഡേഷനുശേഷം, അബ്രമോവിച്ച് വിവരിച്ച സൈക്ലോകണ്ടൻസേഷൻ പ്രതിപ്രവർത്തനം 90 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ ബെൻസീനിൽ നടത്തി, ആവശ്യമുള്ള 1-ഹൈഡ്രോക്സി-1എച്ച്-പൈറോൾ-2-കാർബോണിട്രൈൽ 5 ഗ്രാമിൽ ലഭിക്കും.വേഗത 60% (രണ്ട് ഘട്ടങ്ങൾ).15,16.4 ൻ്റെ മെഥൈലേഷനും ജലവിശ്ലേഷണവും പിന്നീട് 1-മെത്തോക്സി-1H-പൈറോൾ-2-കാർബോക്‌സിലിക് ആസിഡ് (“ക്യൂമോട്ടോണിക് ആസിഡ്”, 6 എന്ന് വിളിക്കപ്പെടുന്നു) നല്ല വിളവ് (70%, രണ്ട് ഘട്ടങ്ങൾ) നൽകി.അവസാനമായി, ജലീയ അമോണിയ ഉപയോഗിച്ച് ആസിഡ് ക്ലോറൈഡ് ഇൻ്റർമീഡിയറ്റ് 6 വഴിയുള്ള അമ്ഡേഷൻ 98% വിളവിൽ കുമാമോട്ടോ അമൈഡ് 1 നൽകി.സമന്വയിപ്പിച്ച 1 ൻ്റെ എല്ലാ സ്പെക്ട്രൽ ഡാറ്റയും ഒറ്റപ്പെട്ട 1 ന് സമാനമാണ്, അതിനാൽ 1 ൻ്റെ ഘടന നിർണ്ണയിച്ചു;
ഉർബെനാമൈഡിൻ്റെയും ഉർബെനിക് ആസിഡിൻ്റെയും ജൈവിക പ്രവർത്തനത്തിൻ്റെ പൊതുവായ സമന്വയവും വിശകലനവും.(എ) കുമാമോട്ടോ അമൈഡിൻ്റെ ആകെ സമന്വയം.(ബി) ഏഴ് ദിവസം പ്രായമായ കാട്ടു-തരം അറബിഡോപ്സിസ് കൊളംബിയ (കോൾ) തൈകൾ, സൂചിപ്പിച്ച സാന്ദ്രതയിൽ കൂമമോണമൈഡ് 6 അല്ലെങ്കിൽ കൂമമോണമൈഡ് 1 അടങ്ങിയ മുരാഷിഗെ, സ്കൂഗ് (എംഎസ്) പ്ലേറ്റുകളിൽ വളർത്തി.സ്കെയിൽ ബാർ = 1 സെ.മീ.
ആദ്യം, സസ്യവളർച്ചയെ മോഡുലേറ്റ് ചെയ്യാനുള്ള കഴിവിനായി ഉർബെനാമൈഡിൻ്റെയും അതിൻ്റെ ഇടനിലക്കാരുടെയും ജൈവിക പ്രവർത്തനങ്ങൾ ഞങ്ങൾ വിലയിരുത്തി.MS അഗർ മീഡിയത്തിൽ ഞങ്ങൾ ursmonamide 1 അല്ലെങ്കിൽ ursmonic acid 6 ൻ്റെ വിവിധ സാന്ദ്രതകളും ഈ മാധ്യമത്തിൽ സംസ്കരിച്ച അറബിഡോപ്സിസ് താലിയാന തൈകളും ചേർത്തു.6 ൻ്റെ ഉയർന്ന സാന്ദ്രത (500 μM) റൂട്ട് വളർച്ചയെ തടസ്സപ്പെടുത്തുന്നതായി ഈ വിശകലനങ്ങൾ കാണിച്ചു (ചിത്രം 2 ബി).അടുത്തതായി, 6 ൻ്റെ N1 സ്ഥാനത്തിന് പകരമായി ഞങ്ങൾ വിവിധ ഡെറിവേറ്റീവുകൾ സൃഷ്ടിക്കുകയും അവയിൽ ഘടന-പ്രവർത്തന ബന്ധ പഠനങ്ങൾ നടത്തുകയും ചെയ്തു (അനലോഗ് സിന്തസിസ് പ്രക്രിയയെ പിന്തുണയ്ക്കുന്ന വിവരങ്ങളിൽ (SI) വിവരിച്ചിരിക്കുന്നു).50 μM ഉർസോണിക് ആസിഡ് ഡെറിവേറ്റീവുകൾ അടങ്ങിയ ഒരു മാധ്യമത്തിൽ അറബിഡോപ്സിസ് തൈകൾ വളർത്തി, വേരിൻ്റെ നീളം അളന്നു.ചിത്രത്തിൽ കാണിച്ചിരിക്കുന്നതുപോലെ.ചിത്രം 3a, b, S1 എന്നിവയിൽ കാണിച്ചിരിക്കുന്നതുപോലെ, കൂമാമോ ആസിഡുകൾക്ക് N1 സ്ഥാനത്ത് ലീനിയർ ആൽക്കോക്സി ശൃംഖലകൾ (9, 10, 11, 12, 13) അല്ലെങ്കിൽ വലിയ ആൽക്കോക്സി ചെയിനുകൾ (15, 16, 17) ഉണ്ട്.ഡെറിവേറ്റീവുകൾ റൂട്ട് വളർച്ചയിൽ കാര്യമായ തടസ്സം കാണിച്ചു.കൂടാതെ, 200 μM 10, 11, അല്ലെങ്കിൽ 17 എന്നിവയുടെ പ്രയോഗം മുളയ്ക്കുന്നത് തടയുന്നതായി ഞങ്ങൾ കണ്ടെത്തി (ചിത്രം 3 സി, എസ് 2).
കുമാമോട്ടോ അമൈഡിൻ്റെയും അനുബന്ധ സംയുക്തങ്ങളുടെയും ഘടന-പ്രവർത്തന ബന്ധത്തെക്കുറിച്ചുള്ള പഠനം.(എ) അനലോഗുകളുടെ ഘടനയും സമന്വയവും.(b) 50 μM coumamonamide ഡെറിവേറ്റീവുകൾ ഉപയോഗിച്ചോ അല്ലാതെയോ MS മീഡിയത്തിൽ വളരുന്ന 7 ദിവസം പ്രായമുള്ള തൈകളുടെ വേരിൻ്റെ നീളം അളക്കുക.ആസ്റ്ററിസ്‌ക്കുകൾ വ്യാജ ചികിത്സയുമായി കാര്യമായ വ്യത്യാസങ്ങൾ സൂചിപ്പിക്കുന്നു (ടി ടെസ്റ്റ്, പി< 0.05).n>18. ഡാറ്റ ശരാശരി ± SD ആയി കാണിക്കുന്നു.nt എന്നാൽ "പരീക്ഷിച്ചിട്ടില്ല" എന്നാണ് അർത്ഥമാക്കുന്നത്, കാരണം 50% വിത്തുകളിൽ കൂടുതൽ മുളപ്പിച്ചില്ല.(സി) 200 μM കൂമമോണമൈഡും അനുബന്ധ സംയുക്തങ്ങളും ഉപയോഗിച്ചോ അല്ലാതെയോ MS മീഡിയത്തിൽ 7 ദിവസത്തേക്ക് ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്ത സംസ്കരിച്ച വിത്തുകളുടെ മുളയ്ക്കൽ നിരക്ക് അളക്കുക.ആസ്റ്ററിക്‌സ് ഷാം ട്രീറ്റ്‌മെൻ്റുമായി (ചി-സ്ക്വയർ ടെസ്റ്റ്) കാര്യമായ വ്യത്യാസങ്ങൾ സൂചിപ്പിക്കുന്നു.n=96.
രസകരമെന്നു പറയട്ടെ, C9-നേക്കാൾ നീളമുള്ള ആൽക്കൈൽ സൈഡ് ചെയിനുകൾ ചേർക്കുന്നത് തടസ്സപ്പെടുത്തുന്ന പ്രവർത്തനം കുറച്ചു, കുമാമോട്ടോയിക് ആസിഡുമായി ബന്ധപ്പെട്ട സംയുക്തങ്ങൾക്ക് അവയുടെ ജൈവിക പ്രവർത്തനം പ്രകടിപ്പിക്കുന്നതിന് ഒരു നിശ്ചിത വലുപ്പത്തിലുള്ള സൈഡ് ചെയിൻ ആവശ്യമാണെന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു.
ഘടന-പ്രവർത്തന ബന്ധ വിശകലനം C9 ഉർസോണിക് ആസിഡാക്കി മാറ്റുകയും ഉർസോണിക് ആസിഡിൻ്റെ nonyloxy ഡെറിവേറ്റീവ് (ഇനി KAND 11 എന്നറിയപ്പെടുന്നു) ഏറ്റവും ഫലപ്രദമായ സസ്യവളർച്ച തടയൽ ആണെന്നും കാണിക്കുന്നു, ഞങ്ങൾ KAND 11 ൻ്റെ കൂടുതൽ വിശദമായ സ്വഭാവം നടത്തി. അറബിഡോപ്സിസ് ചികിത്സ 50 μM KAND 11 ഉപയോഗിച്ച് മുളയ്ക്കുന്നത് ഏതാണ്ട് പൂർണ്ണമായും തടഞ്ഞു, എന്നാൽ KAND 11 ൻ്റെ കുറഞ്ഞ സാന്ദ്രത (40, 30, 20, അല്ലെങ്കിൽ 10 μM) ഡോസ്-ആശ്രിത രീതിയിൽ റൂട്ട് വളർച്ചയെ തടയുന്നു (ചിത്രം 4a, b).KAND 11 റൂട്ട് മെറിസ്റ്റം പ്രവർത്തനക്ഷമതയെ ബാധിക്കുന്നുണ്ടോ എന്ന് പരിശോധിക്കാൻ, ഞങ്ങൾ പ്രോപ്പിഡിയം അയഡൈഡ് (PI) കൊണ്ട് കറ പുരണ്ട റൂട്ട് മെറിസ്റ്റം പരിശോധിച്ച് മെറിസ്റ്റം ഏരിയ സൈസ് അളന്നു.25 μM KAND-11 അടങ്ങിയ ഒരു മാധ്യമത്തിൽ വളരുന്ന തൈകളുടെ മെറിസ്റ്റത്തിൻ്റെ വലുപ്പം 151.1 ± 32.5 μm ആയിരുന്നു, അതേസമയം DMSO അടങ്ങിയ ഒരു നിയന്ത്രണ മാധ്യമത്തിൽ വളരുന്ന തൈകളുടെ മെറിസ്റ്റത്തിൻ്റെ വലുപ്പം 264.7 ± 30.8 μm ആയിരുന്നു (ചിത്രം. 4c, , KAND-11 സെല്ലുലാർ പ്രവർത്തനം പുനഃസ്ഥാപിക്കുന്നുവെന്ന് ഇത് സൂചിപ്പിക്കുന്നു.പടരുന്ന.റൂട്ട് മെറിസ്റ്റം.ഇതിന് അനുസൃതമായി, KAND 11 ചികിത്സ, റൂട്ട് മെറിസ്റ്റമിലെ CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS സിഗ്നൽ (ചിത്രം 4e) 17 എന്ന സെൽ ഡിവിഷൻ മാർക്കറിൻ്റെ അളവ് കുറച്ചു.ഈ ഫലങ്ങൾ സൂചിപ്പിക്കുന്നത്, കോശങ്ങളുടെ വ്യാപന പ്രവർത്തനം കുറയ്ക്കുന്നതിലൂടെ KAND 11 റൂട്ട് വളർച്ചയെ തടയുന്നു എന്നാണ്.
വളർച്ചയിൽ ഉർബെനോണിക് ആസിഡ് ഡെറിവേറ്റീവുകളുടെ (അർബെനൈലോക്സി ഡെറിവേറ്റീവുകൾ) തടസ്സപ്പെടുത്തുന്ന ഫലത്തിൻ്റെ വിശകലനം.(a) KAND 11 ൻ്റെ സൂചിപ്പിച്ച സാന്ദ്രതകളുള്ള MS പ്ലേറ്റുകളിൽ വളരുന്ന 7-ദിവസം പ്രായമുള്ള കാട്ടു-തരം കോൾ തൈകൾ. സ്കെയിൽ ബാർ = 1 സെ.മീ.(ബി) റൂട്ട് നീളത്തിൻ്റെ അളവ്.അക്ഷരങ്ങൾ കാര്യമായ വ്യത്യാസങ്ങൾ സൂചിപ്പിക്കുന്നു (ടൂക്കി എച്ച്എസ്ഡി ടെസ്റ്റ്, പേ< 0.05).n>16. ഡാറ്റ ശരാശരി ± SD ആയി കാണിക്കുന്നു.(സി) 25 μM KAND ഉള്ളതോ അല്ലാതെയോ MS പ്ലേറ്റുകളിൽ വളരുന്ന പ്രൊപിഡിയം അയഡൈഡ്-സ്റ്റെയിൻഡ് വൈൽഡ്-ടൈപ്പ് കോൾ വേരുകളുടെ കോൺഫോക്കൽ മൈക്രോസ്കോപ്പി 11. വെളുത്ത ബ്രാക്കറ്റുകൾ റൂട്ട് മെറിസ്റ്റത്തെ സൂചിപ്പിക്കുന്നു.സ്കെയിൽ ബാർ = 100 µm.(d) റൂട്ട് മെറിസ്റ്റം വലുപ്പത്തിൻ്റെ അളവ് (n = 10 മുതൽ 11 വരെ).ടി-ടെസ്റ്റ് ഉപയോഗിച്ചാണ് സ്ഥിതിവിവരക്കണക്കുകൾ നിർണ്ണയിക്കുന്നത് (പേജ്< 0.05).ബാറുകൾ ശരാശരി മെറിസ്റ്റം വലുപ്പത്തെ പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നു.(ഇ) CDKB2 നിർമ്മിതി അടങ്ങുന്ന ഒരു റൂട്ട് മെറിസ്റ്റത്തിൻ്റെ ഡിഫറൻഷ്യൽ ഇൻ്റർഫെറൻസ് കോൺട്രാസ്റ്റ് (DIC) മൈക്രോസ്കോപ്പി;1പ്രോ: CDKB2;25 µM KAND പരിശോധനയ്‌ക്കൊപ്പം അല്ലെങ്കിൽ അല്ലാതെയും MS പ്ലേറ്റുകളിൽ നട്ടുവളർത്തുന്ന 5 ദിവസം പ്രായമായ തൈകളിൽ 1-GUS കറയും കറയും.
മറ്റൊരു ദ്വിമുഖ സസ്യമായ പുകയിലയും (നിക്കോട്ടിയാന ടാബാക്കം) ഒരു പ്രധാന ലാൻഡ് പ്ലാൻ്റ് മാതൃകാ ജീവിയായ ലിവർവോർട്ടും (മാർച്ചാൻ്റിയ പോളിമോർഫ) ഉപയോഗിച്ചും KAND 11-ൻ്റെ ഫൈറ്റോടോക്സിസിറ്റി കൂടുതൽ പരിശോധിച്ചു.അറബിഡോപ്‌സിസിൻ്റെ കാര്യത്തിലെന്നപോലെ, 25 μM KAND 11 അടങ്ങിയ ഇടത്തരം പുകയില SR-1 തൈകൾ ചെറിയ വേരുകൾ ഉത്പാദിപ്പിക്കുന്നു (ചിത്രം 5a).കൂടാതെ, 48 വിത്തുകളിൽ 40 എണ്ണം 200 μM KAND 11 അടങ്ങിയ പ്ലേറ്റുകളിൽ മുളച്ചു, അതേസമയം 48 വിത്തുകളും മോക്ക്-ട്രീറ്റ് ചെയ്ത മീഡിയയിൽ മുളച്ചു, ഇത് KAND ൻ്റെ ഉയർന്ന സാന്ദ്രത പ്രാധാന്യമുള്ളതാണെന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു (p< 0.05;ചി ടെസ്റ്റ് -സ്ക്വയർ) പുകയില മുളയ്ക്കുന്നതിനെ തടഞ്ഞു.(ചിത്രം 5 ബി).കൂടാതെ, ലിവർവോർട്ടിലെ ബാക്ടീരിയ വളർച്ചയെ തടയുന്ന KAND 11 ൻ്റെ സാന്ദ്രത അറബിഡോപ്സിസിലെ ഫലപ്രദമായ സാന്ദ്രതയ്ക്ക് സമാനമാണ് (ചിത്രം 5c).ഈ ഫലങ്ങൾ സൂചിപ്പിക്കുന്നത് KAND 11 ന് പലതരം സസ്യങ്ങളുടെ വളർച്ചയെ തടയാൻ കഴിയുമെന്നാണ്.യഥാക്രമം ഉയർന്ന ജന്തുക്കളുടെയും ബാക്ടീരിയൽ കോശങ്ങളുടെയും പ്രതിനിധികളായി മറ്റ് ജീവികളിൽ കരടി മോണോഅമൈഡുമായി ബന്ധപ്പെട്ട സംയുക്തങ്ങളുടെ സാധ്യമായ സൈറ്റോടോക്സിസിറ്റി ഞങ്ങൾ അന്വേഷിച്ചു.സെൽ പ്രൊലിഫെറേഷൻ അസ്സെകളുടെ ഒരു പരമ്പരയിൽ, 100 μM (ചിത്രം. 5d,e) സാന്ദ്രതയിലുള്ള HeLa അല്ലെങ്കിൽ E. coli കോശങ്ങളുടെ വളർച്ചയെ coumamonamide 1, coumomonamidic ആസിഡ് 6, KAND 11 എന്നിവ ബാധിക്കുന്നില്ലെന്ന് ഞങ്ങൾ നിരീക്ഷിച്ചു.
അറബിഡോപ്സിസ് ഇതര ജീവികളിൽ KAND 11-ൻ്റെ വളർച്ച തടയുന്നു.(a) രണ്ടാഴ്ച പ്രായമുള്ള കാട്ടു-തരം SR-1 പുകയില തൈകൾ 25 μM KAND 11 അടങ്ങിയ ലംബമായി സ്ഥാനമുള്ള MS പ്ലേറ്റുകളിൽ വളർത്തി. 200 μM KAND അടങ്ങിയ MS പ്ലേറ്റുകൾ 11. (സി) ഗാംബോർഗ് B5 പ്ലേറ്റുകളിൽ KAND 11 ൻ്റെ സൂചിപ്പിച്ച സാന്ദ്രതകളുള്ള രണ്ടാഴ്ച പഴക്കമുള്ള വൈൽഡ്-ടൈപ്പ് Tak-1 ലിവർവോർട്ട് മുകുളങ്ങൾ. ചുവന്ന അമ്പടയാളങ്ങൾ സൂചിപ്പിക്കുന്നത് രണ്ടാഴ്ചത്തെ ഇൻകുബേഷനിൽ വളരുന്ന ബീജങ്ങളെയാണ് കാലഘട്ടം.(d) HeLa കോശങ്ങളുടെ കോശ വ്യാപന പരിശോധന.സെൽ കൗണ്ടിംഗ് കിറ്റ് 8 (ഡോജിൻഡോ) ഉപയോഗിച്ച് നിശ്ചിത സമയ ഇടവേളകളിൽ പ്രവർത്തനക്ഷമമായ സെല്ലുകളുടെ എണ്ണം അളക്കുന്നു.ഒരു നിയന്ത്രണമെന്ന നിലയിൽ, HeLa കോശങ്ങളെ 5 μg/ml ആക്റ്റിനോമൈസിൻ D (Act D) ഉപയോഗിച്ച് ചികിത്സിച്ചു, ഇത് RNA പോളിമറേസ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷനെ തടയുകയും കോശങ്ങളുടെ മരണത്തിന് കാരണമാവുകയും ചെയ്യുന്നു.മൂന്ന് തവണയായി വിശകലനങ്ങൾ നടത്തി.(ഇ) ഇ.കോളി സെൽ പ്രൊലിഫെറേഷൻ അസ്സെ.OD600 അളക്കുന്നതിലൂടെ E. coli വളർച്ച വിശകലനം ചെയ്തു.ഒരു നിയന്ത്രണമെന്ന നിലയിൽ, കോശങ്ങളെ 50 μg/ml ആംപിസിലിൻ (Amp) ഉപയോഗിച്ച് ചികിത്സിച്ചു, ഇത് ബാക്ടീരിയയുടെ സെൽ മതിൽ സമന്വയത്തെ തടയുന്നു.മൂന്ന് തവണയായി വിശകലനങ്ങൾ നടത്തി.
യുറാമൈഡുമായി ബന്ധപ്പെട്ട സംയുക്തങ്ങൾ മൂലമുണ്ടാകുന്ന സൈറ്റോടോക്സിസിറ്റിയുടെ പ്രവർത്തനരീതി മനസ്സിലാക്കാൻ, മിതമായ പ്രതിരോധ ഫലങ്ങളുള്ള അർബെനിക് ആസിഡ് ഡെറിവേറ്റീവുകൾ ഞങ്ങൾ പുനർവിശകലനം ചെയ്തു.ചിത്രത്തിൽ കാണിച്ചിരിക്കുന്നതുപോലെ.ചിത്രം 2b, 6a-ൽ കാണിച്ചിരിക്കുന്നതുപോലെ, ഉയർന്ന സാന്ദ്രത (200 μM) ഉർമോട്ടോണിക് ആസിഡ് 6 അടങ്ങിയ അഗർ പ്ലേറ്റുകളിൽ വളരുന്ന തൈകൾ ചെറുതും ഇടത് വളഞ്ഞതുമായ വേരുകൾ (θ = - 23.7 ± 6.1) ഉത്പാദിപ്പിക്കുന്നു, അതേസമയം നിയന്ത്രണ മാധ്യമത്തിൽ വളരുന്ന തൈകൾ, തൈകൾ ഏതാണ്ട് നേരായ വേരുകൾ ഉത്പാദിപ്പിക്കുന്നു (θ = - 3.8 ± 7.1).ഈ സ്വഭാവഗുണമുള്ള ചരിഞ്ഞ വളർച്ച കോർട്ടിക്കൽ മൈക്രോട്യൂബ്യൂളുകളുടെ പ്രവർത്തനരഹിതമായ ഫലമായാണ് അറിയപ്പെടുന്നത്14,18.ഈ കണ്ടെത്തലിന് അനുസൃതമായി, മൈക്രോട്യൂബ്യൂൾ അസ്ഥിരപ്പെടുത്തുന്ന മരുന്നുകളായ ഡിസോപിറാമൈഡും ഒറിസാലിനും നമ്മുടെ വളർച്ചാ സാഹചര്യങ്ങളിൽ സമാനമായ റൂട്ട് ടിൽറ്റിംഗിനെ പ്രേരിപ്പിച്ചു (ചിത്രം 2 ബി, 6 എ).അതേ സമയം, ഞങ്ങൾ ഉർമോട്ടോണിക് ആസിഡ് ഡെറിവേറ്റീവുകൾ പരീക്ഷിക്കുകയും അവയിൽ പലതും തിരഞ്ഞെടുത്തു, ചില സാന്ദ്രതകളിൽ, ചരിഞ്ഞ റൂട്ട് വളർച്ചയ്ക്ക് കാരണമാകുന്നു.8, 9, 15 എന്നീ സംയുക്തങ്ങൾ യഥാക്രമം 75 μM, 50 μM, 40 μM എന്നിവയിൽ റൂട്ട് വളർച്ചയുടെ ദിശ മാറ്റി, ഈ സംയുക്തങ്ങൾക്ക് മൈക്രോട്യൂബുളുകളെ ഫലപ്രദമായി അസ്ഥിരപ്പെടുത്താൻ കഴിയുമെന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു (ചിത്രം 2 ബി, 6 എ).ഞങ്ങൾ ഏറ്റവും ശക്തിയേറിയ ഉർസോളിക് ആസിഡ് ഡെറിവേറ്റീവായ KAND 11, കുറഞ്ഞ സാന്ദ്രതയിൽ (15 µM) പരീക്ഷിച്ചു, KAND 11 ൻ്റെ പ്രയോഗം റൂട്ട് വളർച്ചയെ തടയുന്നുവെന്നും റൂട്ട് വളർച്ചയുടെ ദിശ അസമത്വമുള്ളതാണെന്നും കണ്ടെത്തി, അവ ഇടത്തേക്ക് ചരിഞ്ഞാലും ( ചിത്രം C3)..മൈക്രോട്യൂബ്യൂൾ അസ്ഥിരമാക്കുന്ന മരുന്നുകളുടെ ഉയർന്ന സാന്ദ്രത ചിലപ്പോൾ ചെടിയുടെ വളർച്ചയെ തടസ്സപ്പെടുത്തുന്നു, പക്ഷേ റൂട്ട് ചെരിവുണ്ടാക്കുന്നതിനുപകരം, റൂട്ട് എപ്പിഡെർമൽ കോശങ്ങളിലെ കോർട്ടിക്കൽ മൈക്രോട്യൂബുളുകൾ നിരീക്ഷിച്ച് KAND 11 മൈക്രോട്യൂബുളുകളെ ബാധിക്കാനുള്ള സാധ്യത ഞങ്ങൾ പിന്നീട് വിലയിരുത്തി.25 μM KAND 11 ഉപയോഗിച്ച് ചികിത്സിക്കുന്ന തൈ വേരുകളുടെ എപിഡെർമൽ സെല്ലുകളിൽ ആൻ്റി-β-ട്യൂബുലിൻ ആൻ്റിബോഡികൾ ഉപയോഗിച്ചുള്ള ഇമ്മ്യൂണോഹിസ്റ്റോകെമിസ്ട്രി, ദീർഘവൃത്താകൃതിയിലുള്ള എപിഡെർമൽ കോശങ്ങളിലെ മിക്കവാറും എല്ലാ കോർട്ടിക്കൽ മൈക്രോട്യൂബുലുകളുടെയും അപ്രത്യക്ഷത കാണിച്ചു (ചിത്രം 6 ബി).ഈ ഫലങ്ങൾ സൂചിപ്പിക്കുന്നത് കുമാമോട്ടോണിക് ആസിഡും അതിൻ്റെ ഡെറിവേറ്റീവുകളും മൈക്രോട്യൂബുലുകളിൽ നേരിട്ടോ അല്ലാതെയോ പ്രവർത്തിക്കുകയും അവയെ തടസ്സപ്പെടുത്തുകയും ചെയ്യുന്നുവെന്നും ഈ സംയുക്തങ്ങൾ പുതിയ മൈക്രോട്യൂബ്യൂൾ ഇൻഹിബിറ്ററുകളാണെന്നും സൂചിപ്പിക്കുന്നു.
ഉർസോണിക് ആസിഡും അതിൻ്റെ ഡെറിവേറ്റീവുകളും അറബിഡോപ്സിസ് താലിയാനയിലെ കോർട്ടിക്കൽ മൈക്രോട്യൂബുളുകളെ മാറ്റുന്നു.(എ) സൂചിപ്പിച്ച സാന്ദ്രതയിൽ വിവിധ ഉർമോട്ടോണിക് ആസിഡ് ഡെറിവേറ്റീവുകളുടെ സാന്നിധ്യത്തിൽ റൂട്ട് ചെരിവ് ആംഗിൾ അളക്കുന്നു.മൈക്രോട്യൂബുളുകളെ തടയുന്ന രണ്ട് സംയുക്തങ്ങളുടെ ഫലങ്ങളും വിശകലനം ചെയ്തു: ഡിസോപിറാമൈഡ്, ഒറിസാലിൻ.റൂട്ട് വളർച്ചാ ആംഗിൾ അളക്കാൻ ഉപയോഗിക്കുന്ന സ്റ്റാൻഡേർഡ് ഇൻസെറ്റ് കാണിക്കുന്നു.ആസ്ട്രിസ്‌ക്കുകൾ വ്യാജ ചികിത്സയുമായി കാര്യമായ വ്യത്യാസങ്ങൾ സൂചിപ്പിക്കുന്നു (ടി ടെസ്റ്റ്, പി< 0.05).n>19. സ്കെയിൽ ബാർ = 1 സെ.മീ.(ബി) ദീർഘവൃത്താകൃതിയിലുള്ള എപ്പിഡെർമൽ കോശങ്ങളിലെ കോർട്ടിക്കൽ മൈക്രോട്യൂബുകൾ.25 μM KAND 11 ഉള്ളതോ അല്ലാതെയോ MS പ്ലേറ്റുകളിൽ വളരുന്ന വൈൽഡ്-ടൈപ്പ് അറബിഡോപ്സിസ് കോൾ വേരുകളിലെ മൈക്രോട്യൂബുളുകൾ β-ട്യൂബുലിൻ പ്രൈമറി ആൻ്റിബോഡികളും അലക്സാ ഫ്ലൂർ-കൺജഗേറ്റഡ് സെക്കൻഡറി ആൻ്റിബോഡികളും ഉപയോഗിച്ച് ഇമ്മ്യൂണോഹിസ്റ്റോകെമിക്കൽ സ്റ്റെയിനിംഗ് വഴി ദൃശ്യവൽക്കരിച്ചു.സ്കെയിൽ ബാർ = 10 µm.(സി) റൂട്ട് മെറിസ്റ്റമിലെ മൈക്രോട്യൂബ്യൂളുകളുടെ മൈറ്റോട്ടിക് ഘടന.ഇമ്മ്യൂണോഹിസ്റ്റോകെമിക്കൽ സ്റ്റെയിനിംഗ് ഉപയോഗിച്ച് മൈക്രോട്യൂബ്യൂളുകൾ ദൃശ്യവൽക്കരിച്ചു.പ്രോഫേസ് സോണുകൾ, സ്പിൻഡിലുകൾ, ഫ്രാഗ്മോപ്ലാസ്റ്റുകൾ എന്നിവയുൾപ്പെടെയുള്ള മൈറ്റോട്ടിക് ഘടനകൾ കൺഫോക്കൽ ചിത്രങ്ങളിൽ നിന്ന് കണക്കാക്കി.അമ്പടയാളങ്ങൾ മൈറ്റോട്ടിക് മൈക്രോട്യൂബ്യൂൾ ഘടനകളെ സൂചിപ്പിക്കുന്നു.ആസ്റ്ററിസ്‌ക്കുകൾ വ്യാജ ചികിത്സയുമായി കാര്യമായ വ്യത്യാസങ്ങൾ സൂചിപ്പിക്കുന്നു (ടി ടെസ്റ്റ്, പി< 0.05).n>9. സ്കെയിൽ ബാർ = 50 µm.
ഉർസയ്ക്ക് മൈക്രോട്യൂബ്യൂൾ പ്രവർത്തനത്തെ തടസ്സപ്പെടുത്താനുള്ള കഴിവുണ്ടെങ്കിലും, അതിൻ്റെ പ്രവർത്തന സംവിധാനം സാധാരണ മൈക്രോട്യൂബ്യൂൾ ഡിപോളിമറൈസിംഗ് ഏജൻ്റുകളിൽ നിന്ന് വ്യത്യസ്തമായിരിക്കും.ഉദാഹരണത്തിന്, ഡിസോപിറാമൈഡ്, ഒറിസാലിൻ തുടങ്ങിയ മൈക്രോട്യൂബ്യൂൾ ഡിപോളിമറൈസിംഗ് ഏജൻ്റുകളുടെ ഉയർന്ന സാന്ദ്രത എപ്പിഡെർമൽ സെല്ലുകളുടെ അനിസോട്രോപിക് വികാസത്തിന് കാരണമാകുന്നു, എന്നാൽ KAND 11 അങ്ങനെ ചെയ്യുന്നില്ല.കൂടാതെ, KAND 11, disopyramide എന്നിവയുടെ സഹ-പ്രയോഗം ഒരു സംയോജിത ഡിസോപിറാമൈഡ്-ഇൻഡ്യൂസ്ഡ് റൂട്ട് വളർച്ചാ പ്രതികരണത്തിന് കാരണമാവുകയും KAND 11-ഇൻഡ്യൂസ്ഡ് വളർച്ച തടയുകയും ചെയ്തു (ചിത്രം S4).KAND 11-ലേക്കുള്ള ഹൈപ്പർസെൻസിറ്റീവ് ഡിസോപൈറാമൈഡ് 1-1 (phs1-1) ൻ്റെ പ്രതികരണവും ഞങ്ങൾ വിശകലനം ചെയ്തു. phs1-1-ന് കാനോനിക്കൽ അല്ലാത്ത ട്യൂബുലിൻ കൈനസ് പോയിൻ്റ് മ്യൂട്ടേഷൻ ഉണ്ട്, ഡിസോപിറാമൈഡ് 9,20 ഉപയോഗിച്ച് ചികിത്സിക്കുമ്പോൾ ചെറിയ വേരുകൾ ഉത്പാദിപ്പിക്കുന്നു.KAND 11 അടങ്ങിയ അഗർ മീഡിയത്തിൽ വളരുന്ന phs1-1 മ്യൂട്ടൻ്റ് തൈകൾക്ക് ഡിസോപിരമിഡിൽ (അത്തിപ്പഴം S5) വളരുന്നതിന് സമാനമായ വേരുകൾ ചെറുതാണ്.
കൂടാതെ, KAND 11 ഉപയോഗിച്ച് ചികിത്സിച്ച തൈകളുടെ റൂട്ട് മെറിസ്റ്റമിൽ പ്രോഫേസ് സോണുകൾ, സ്പിൻഡിൽസ്, ഫ്രാഗ്മോപ്ലാസ്റ്റുകൾ തുടങ്ങിയ മൈറ്റോട്ടിക് മൈക്രോട്യൂബ് ഘടനകൾ ഞങ്ങൾ നിരീക്ഷിച്ചു. മൈറ്റോട്ടിക് മൈക്രോട്യൂബ്യൂളുകളുടെ എണ്ണം നിരീക്ഷിക്കപ്പെട്ടു (ചിത്രം .6c).
ഉപസെല്ലുലാർ റെസല്യൂഷനിൽ KAND 11-ൻ്റെ സൈറ്റോടോക്സിസിറ്റി വ്യക്തമാക്കുന്നതിന്, ഞങ്ങൾ KAND 11 ഉപയോഗിച്ച് പുകയില BY-2 സസ്പെൻഷൻ സെല്ലുകളെ ചികിത്സിക്കുകയും അവയുടെ പ്രതികരണം നിരീക്ഷിക്കുകയും ചെയ്തു.കോർട്ടിക്കൽ മൈക്രോട്യൂബുലുകളിൽ KAND 11 ൻ്റെ പ്രഭാവം വിലയിരുത്തുന്നതിന് ഞങ്ങൾ ആദ്യം KAND 11-നെ BY-2 സെല്ലുകളിലേക്ക് ചേർത്തു, ഇത് TagRFP-TUA6 പ്രകടിപ്പിക്കുന്നു, ഇത് മൈക്രോട്യൂബുളുകളെ ഫ്ലൂറസൻ്റ് ലേബൽ ചെയ്യുന്നു.ഇമേജ് വിശകലനം ഉപയോഗിച്ച് കോർട്ടിക്കൽ മൈക്രോട്യൂബ് ഡെൻസിറ്റി വിലയിരുത്തി, ഇത് സൈറ്റോപ്ലാസ്മിക് പിക്സലുകൾക്കിടയിൽ സൈറ്റോസ്കെലെറ്റൽ പിക്സലുകളുടെ ശതമാനം കണക്കാക്കുന്നു.1 മണിക്കൂർ 50 μM അല്ലെങ്കിൽ 100 ​​μM KAND 11 ഉപയോഗിച്ചുള്ള ചികിത്സയ്ക്ക് ശേഷം, സാന്ദ്രത യഥാക്രമം 0.94 ± 0.74% അല്ലെങ്കിൽ 0.23 ± 0.28% ആയി കുറഞ്ഞു, അതേസമയം DMSO ഉപയോഗിച്ച് ചികിത്സിച്ച സെല്ലുകളുടെ സാന്ദ്രത 1.63 ആയി കുറഞ്ഞു. % (ചിത്രം 7a).ഈ ഫലങ്ങൾ അറബിഡോപ്സിസിലെ നിരീക്ഷണവുമായി പൊരുത്തപ്പെടുന്നു, KAND 11 ചികിത്സ കോർട്ടിക്കൽ മൈക്രോട്യൂബ്യൂളുകളുടെ ഡിപോളിമറൈസേഷനെ പ്രേരിപ്പിക്കുന്നു (ചിത്രം 6 ബി).KAND 11-ൻ്റെ അതേ സാന്ദ്രതയുള്ള ചികിത്സയ്ക്ക് ശേഷം GFP-ABD-ലേബൽ ചെയ്ത ആക്റ്റിൻ ഫിലമെൻ്റുകൾ ഉപയോഗിച്ച് ഞങ്ങൾ BY-2 ലൈനും പരിശോധിച്ചു, കൂടാതെ KAND 11 ചികിത്സ ആക്റ്റിൻ ഫിലമെൻ്റുകളെ തടസ്സപ്പെടുത്തിയതായി നിരീക്ഷിച്ചു.1 മണിക്കൂറിന് 50 μM അല്ലെങ്കിൽ 100 ​​μM KAND 11 ഉപയോഗിച്ചുള്ള ചികിത്സ, ആക്ടിൻ ഫിലമെൻ്റ് സാന്ദ്രത യഥാക്രമം 1.20 ± 0.62% അല്ലെങ്കിൽ 0.61 ± 0.26% ആയി കുറച്ചു, അതേസമയം DMSO- ചികിത്സിച്ച സെല്ലുകളിലെ സാന്ദ്രത 1 ± ± 1.69 ആയിരുന്നു.7b).ഈ ഫലങ്ങൾ ആക്റ്റിൻ ഫിലമെൻ്റുകളെ ബാധിക്കാത്ത പ്രൊപിസാമൈഡിൻ്റെയും മൈക്രോട്യൂബുലുകളെ ബാധിക്കാത്ത ആക്റ്റിൻ ഡിപോളിമറൈസറായ ലാട്രൻകുലിൻ ബിയുടെയും ഫലങ്ങളുമായി വ്യത്യസ്തമാണ് (SI ചിത്രം S6).കൂടാതെ, coumamonamide 1, coumamonamide ആസിഡ് 6, അല്ലെങ്കിൽ KAND 11 എന്നിവ ഉപയോഗിച്ചുള്ള ചികിത്സ HeLa കോശങ്ങളിലെ മൈക്രോട്യൂബുലുകളെ ബാധിച്ചില്ല (SI ചിത്രം S7).അതിനാൽ, KAND 11-ൻ്റെ പ്രവർത്തനരീതി അറിയപ്പെടുന്ന സൈറ്റോസ്‌കെലിറ്റൺ ഡിസ്‌റപ്റ്ററുകളിൽ നിന്ന് വ്യത്യസ്തമാണെന്ന് വിശ്വസിക്കപ്പെടുന്നു.കൂടാതെ, KAND 11 ഉപയോഗിച്ച് ചികിത്സിച്ച BY-2 സെല്ലുകളെക്കുറിച്ചുള്ള ഞങ്ങളുടെ സൂക്ഷ്മ നിരീക്ഷണം KAND 11 ചികിത്സയ്ക്കിടെ കോശങ്ങളുടെ മരണത്തിൻ്റെ ആരംഭം വെളിപ്പെടുത്തുകയും 30 മിനിറ്റ് KAND 11 ചികിത്സയ്ക്ക് ശേഷം ഇവാൻസിൻ്റെ നീല നിറത്തിലുള്ള മൃതകോശങ്ങളുടെ അനുപാതം ഗണ്യമായി വർദ്ധിച്ചിട്ടില്ലെന്ന് കാണിക്കുകയും ചെയ്തു. 50 μM അല്ലെങ്കിൽ 100 ​​μM KAND ഉപയോഗിച്ച് 90 മിനിറ്റ് ചികിത്സയ്ക്ക് ശേഷം, മൃതകോശങ്ങളുടെ എണ്ണം യഥാക്രമം 43.7% അല്ലെങ്കിൽ 80.1% ആയി വർദ്ധിച്ചു (ചിത്രം 7c).ഒരുമിച്ച് എടുത്താൽ, നോവൽ ഉർസോളിക് ആസിഡ് ഡെറിവേറ്റീവ് KAND 11 എന്നത് മുമ്പ് അറിയപ്പെടാത്ത പ്രവർത്തന സംവിധാനമുള്ള ഒരു സസ്യ-നിർദ്ദിഷ്ട സൈറ്റോസ്‌കെലെറ്റൽ ഇൻഹിബിറ്ററാണെന്ന് ഈ ഡാറ്റ സൂചിപ്പിക്കുന്നു.
KAND കോർട്ടിക്കൽ മൈക്രോട്യൂബുളുകൾ, ആക്റ്റിൻ ഫിലമെൻ്റുകൾ, പുകയില BY-2 കോശങ്ങളുടെ പ്രവർത്തനക്ഷമത എന്നിവയെ ബാധിക്കുന്നു.(a) TagRFP-TUA6 ൻ്റെ സാന്നിധ്യത്തിൽ BY-2 സെല്ലുകളിലെ കോർട്ടിക്കൽ മൈക്രോട്യൂബുളുകളുടെ ദൃശ്യവൽക്കരണം.KAND 11 (50 μM അല്ലെങ്കിൽ 100 ​​μM) അല്ലെങ്കിൽ DMSO ഉപയോഗിച്ച് ചികിത്സിച്ച BY-2 സെല്ലുകൾ കൺഫോക്കൽ മൈക്രോസ്കോപ്പി ഉപയോഗിച്ച് പരിശോധിച്ചു.25 സ്വതന്ത്ര സെല്ലുകളുടെ മൈക്രോഗ്രാഫുകളിൽ നിന്നാണ് കോർട്ടിക്കൽ മൈക്രോട്യൂബ്യൂൾ സാന്ദ്രത കണക്കാക്കുന്നത്.അക്ഷരങ്ങൾ കാര്യമായ വ്യത്യാസങ്ങൾ സൂചിപ്പിക്കുന്നു (ടൂക്കി എച്ച്എസ്ഡി ടെസ്റ്റ്, പേ< 0.05).സ്കെയിൽ ബാർ = 10 µm.(ബി) GFP-ABD2 ൻ്റെ സാന്നിധ്യത്തിൽ BY-2 സെല്ലുകളിലെ കോർട്ടിക്കൽ ആക്റ്റിൻ ഫിലമെൻ്റുകൾ ദൃശ്യവൽക്കരിച്ചു.KAND 11 (50 μM അല്ലെങ്കിൽ 100 ​​μM) അല്ലെങ്കിൽ DMSO ഉപയോഗിച്ച് ചികിത്സിച്ച BY-2 സെല്ലുകൾ കൺഫോക്കൽ മൈക്രോസ്കോപ്പി ഉപയോഗിച്ച് പരിശോധിച്ചു.25 സ്വതന്ത്ര സെല്ലുകളുടെ മൈക്രോഗ്രാഫുകളിൽ നിന്നാണ് കോർട്ടിക്കൽ ആക്റ്റിൻ ഫിലമെൻ്റുകളുടെ സാന്ദ്രത കണക്കാക്കുന്നത്.അക്ഷരങ്ങൾ കാര്യമായ വ്യത്യാസങ്ങൾ സൂചിപ്പിക്കുന്നു (ടൂക്കി എച്ച്എസ്ഡി ടെസ്റ്റ്, പേ< 0.05).സ്കെയിൽ ബാർ = 10 µm.(സി) ഇവാൻസ് ബ്ലൂ സ്റ്റെയിനിംഗ് വഴി മരിച്ച BY-2 സെല്ലുകളുടെ നിരീക്ഷണം.KAND 11 (50 μM അല്ലെങ്കിൽ 100 ​​μM) അല്ലെങ്കിൽ DMSO ഉപയോഗിച്ച് ചികിത്സിച്ച BY-2 സെല്ലുകൾ ബ്രൈറ്റ്-ഫീൽഡ് മൈക്രോസ്കോപ്പി ഉപയോഗിച്ച് പരിശോധിച്ചു.n=3.സ്കെയിൽ ബാർ = 100 µm.
പുതിയ പ്രകൃതിദത്ത ഉൽപ്പന്നങ്ങളുടെ കണ്ടെത്തലും പ്രയോഗവും വൈദ്യശാസ്ത്രവും കൃഷിയും ഉൾപ്പെടെ മനുഷ്യജീവിതത്തിൻ്റെ വിവിധ മേഖലകളിൽ ഗണ്യമായ പുരോഗതിക്ക് കാരണമായി.പ്രകൃതി വിഭവങ്ങളിൽ നിന്ന് ഉപയോഗപ്രദമായ സംയുക്തങ്ങൾ ലഭിക്കുന്നതിന് ചരിത്രപരമായ ഗവേഷണം നടത്തിയിട്ടുണ്ട്.പ്രത്യേകിച്ചും, ആക്‌റ്റിനോമൈസെറ്റുകൾ നെമറ്റോഡുകൾക്ക് ആൻ്റിപാരാസിറ്റിക് ആൻറിബയോട്ടിക്കുകളായി ഉപയോഗപ്രദമാണെന്ന് അറിയപ്പെടുന്നു, കാരണം അവെർമെക്റ്റിൻ, ഐവർമെക്റ്റിൻ, ബ്ലോമൈസിൻ എന്നിവയുടെ ലീഡ് സംയുക്തവും അതിൻ്റെ ഡെറിവേറ്റീവുകളും ഉത്പാദിപ്പിക്കാനുള്ള കഴിവ് 21,22.അതുപോലെ, ആക്റ്റിനോമൈസെറ്റുകളിൽ നിന്ന് വൈവിധ്യമാർന്ന കളനാശിനി സംയുക്തങ്ങൾ കണ്ടെത്തിയിട്ടുണ്ട്, അവയിൽ ചിലത് ഇതിനകം വാണിജ്യപരമായി 1,23 ഉപയോഗിക്കുന്നു.അതിനാൽ, ആവശ്യമുള്ള ജൈവിക പ്രവർത്തനങ്ങളുള്ള പ്രകൃതിദത്ത ഉൽപ്പന്നങ്ങളെ വേർതിരിച്ചെടുക്കാൻ ആക്ടിനോമൈസെറ്റ് മെറ്റബോളിറ്റുകളുടെ വിശകലനം ഫലപ്രദമായ തന്ത്രമായി കണക്കാക്കപ്പെടുന്നു.ഈ പഠനത്തിൽ, എസ്. വെറേൻസിസിൽ നിന്ന് ഒരു പുതിയ സംയുക്തം, coumamonamide, ഞങ്ങൾ കണ്ടെത്തുകയും അത് വിജയകരമായി സമന്വയിപ്പിക്കുകയും ചെയ്തു.ഉർസോണിക് ആസിഡ് ഉർബെനാമൈഡിൻ്റെയും അതിൻ്റെ ഡെറിവേറ്റീവുകളുടെയും സിന്തറ്റിക് ഇൻ്റർമീഡിയറ്റാണ്.ഇത് സ്വഭാവഗുണമുള്ള റൂട്ട് കേളിംഗിന് കാരണമാകും, മിതമായതും ശക്തമായതുമായ കളനാശിനി പ്രവർത്തനം കാണിക്കുന്നു, കൂടാതെ സസ്യ മൈക്രോട്യൂബുലുകളെ നേരിട്ടോ അല്ലാതെയോ നശിപ്പിക്കും.എന്നിരുന്നാലും, ഉർമോട്ടോണിക് ആസിഡിൻ്റെ പ്രവർത്തനരീതി നിലവിലുള്ള മൈക്രോട്യൂബ്യൂൾ ഇൻഹിബിറ്ററുകളിൽ നിന്ന് വ്യത്യസ്തമായിരിക്കാം, കാരണം KAND 11 ആക്റ്റിൻ ഫിലമെൻ്റുകളെ തടസ്സപ്പെടുത്തുകയും കോശങ്ങളുടെ മരണത്തിന് കാരണമാവുകയും ചെയ്യുന്നു..
ഉർബെനോണിക് ആസിഡിൻ്റെ കൂടുതൽ വിശദമായ സ്വഭാവം ഉർബെനോണിക് ആസിഡിൻ്റെ പ്രവർത്തനരീതി നന്നായി മനസ്സിലാക്കാൻ സഹായിക്കും.പ്രത്യേകിച്ചും, ഉർസോണിക് ആസിഡും അതിൻ്റെ ഡെറിവേറ്റീവുകളും മൈക്രോട്യൂബുലുകളിൽ നേരിട്ട് പ്രവർത്തിക്കുകയും അവയെ ഡിപോളിമറൈസ് ചെയ്യുകയും ചെയ്യുന്നുണ്ടോ, അല്ലെങ്കിൽ അവയുടെ പ്രവർത്തനം മൈക്രോട്യൂബ്യൂൾ അസ്ഥിരീകരണത്തിന് കാരണമാകുമോ എന്ന് നിർണ്ണയിക്കാൻ, കുറഞ്ഞ മൈക്രോട്യൂബുലുകളുമായി ബന്ധിപ്പിക്കാനുള്ള ഉർസോണിക് ആസിഡിൻ്റെ കഴിവ് വിലയിരുത്തുക എന്നതാണ് അടുത്ത ലക്ഷ്യം.കൂടാതെ, മൈക്രോട്യൂബ്യൂളുകൾ നേരിട്ടുള്ള ലക്ഷ്യമല്ലെങ്കിൽ, സസ്യകോശങ്ങളിലെ ഉർസോണിക് ആസിഡിൻ്റെ പ്രവർത്തന സ്ഥലവും തന്മാത്രാ ലക്ഷ്യങ്ങളും തിരിച്ചറിയുന്നത് അനുബന്ധ സംയുക്തങ്ങളുടെ ഗുണങ്ങളും കളനാശിനി പ്രവർത്തനം മെച്ചപ്പെടുത്തുന്നതിനുള്ള സാധ്യമായ വഴികളും കൂടുതൽ മനസ്സിലാക്കാൻ സഹായിക്കും.ഞങ്ങളുടെ ബയോ ആക്ടിവിറ്റി അസ്സേ, അറബിഡോപ്സിസ് താലിയാന, പുകയില, ലിവർവോർട്ട് തുടങ്ങിയ സസ്യങ്ങളുടെ വളർച്ചയിൽ ഉർസോണിക് ആസിഡിൻ്റെ അതുല്യമായ സൈറ്റോടോക്സിക് കഴിവ് വെളിപ്പെടുത്തി, അതേസമയം ഇ.കോളിയോ ഹെല കോശങ്ങളോ ബാധിച്ചിട്ടില്ല.തുറസ്സായ കാർഷിക മേഖലകളിൽ ഉപയോഗിക്കുന്നതിന് കളനാശിനികളായി വികസിപ്പിച്ചെടുത്താൽ, മൃഗകോശങ്ങൾക്ക് വിഷാംശം കുറവോ ഇല്ലയോ എന്നത് ഉർസോണിക് ആസിഡ് ഡെറിവേറ്റീവുകളുടെ ഒരു ഗുണമാണ്.തീർച്ചയായും, യൂക്കറിയോട്ടുകളിൽ മൈക്രോട്യൂബ്യൂളുകൾ സാധാരണ ഘടനയായതിനാൽ, സസ്യങ്ങളിൽ അവയുടെ സെലക്ടീവ് ഇൻഹിബിഷൻ കളനാശിനികളുടെ ഒരു പ്രധാന ആവശ്യകതയാണ്.ഉദാഹരണത്തിന്, ട്യൂബുലിനുമായി നേരിട്ട് ബന്ധിപ്പിക്കുകയും പോളിമറൈസേഷനെ തടയുകയും ചെയ്യുന്ന മൈക്രോട്യൂബ്യൂൾ ഡിപോളിമറൈസിംഗ് ഏജൻ്റായ പ്രൊപിസാമൈഡ്, മൃഗകോശങ്ങളോടുള്ള വിഷാംശം കുറവായതിനാൽ കളനാശിനിയായി ഉപയോഗിക്കുന്നു24.ഡിസോപിറാമൈഡിന് വിപരീതമായി, ബന്ധപ്പെട്ട ബെൻസാമൈഡുകൾക്ക് വ്യത്യസ്ത ലക്ഷ്യ സവിശേഷതകൾ ഉണ്ട്.സസ്യ മൈക്രോട്യൂബുളുകൾക്ക് പുറമേ, RH-4032 അല്ലെങ്കിൽ ബെൻസോക്‌സാമൈഡ് യഥാക്രമം മൃഗകോശങ്ങളുടെയോ ഓമിസെറ്റുകളുടെയോ മൈക്രോട്യൂബുലുകളെ തടയുന്നു, കൂടാതെ സാലിലാമൈഡ് അതിൻ്റെ കുറഞ്ഞ ഫൈറ്റോടോക്സിസിറ്റി കാരണം കുമിൾനാശിനിയായി ഉപയോഗിക്കുന്നു25,26,27.പുതുതായി കണ്ടെത്തിയ കരടിയും അതിൻ്റെ ഡെറിവേറ്റീവുകളും സസ്യങ്ങൾക്കെതിരെ സെലക്ടീവ് സൈറ്റോടോക്സിസിറ്റി പ്രകടമാക്കുന്നു, എന്നാൽ കൂടുതൽ പരിഷ്ക്കരണങ്ങൾ അവയുടെ ടാർഗെറ്റ് പ്രത്യേകതയെ മാറ്റിമറിച്ചേക്കാം എന്നത് ശ്രദ്ധിക്കേണ്ടതാണ്, ഇത് രോഗകാരികളായ ഫംഗസുകളുടെയോ ഓമിസെറ്റുകളുടെയോ നിയന്ത്രണത്തിന് അധിക ഡെറിവേറ്റീവുകൾ നൽകുന്നതിന് സാധ്യതയുണ്ട്.
ഉർബെനോണിക് ആസിഡിൻ്റെയും അതിൻ്റെ ഡെറിവേറ്റീവുകളുടെയും തനതായ ഗുണങ്ങൾ അവയെ കളനാശിനികളായി വികസിപ്പിക്കുന്നതിനും ഗവേഷണ ഉപകരണമായി ഉപയോഗിക്കുന്നതിനും ഉപയോഗപ്രദമാണ്.സസ്യകോശങ്ങളുടെ ആകൃതി നിയന്ത്രിക്കുന്നതിൽ സൈറ്റോസ്‌കെലിറ്റണിൻ്റെ പ്രാധാന്യം പരക്കെ അംഗീകരിക്കപ്പെട്ടതാണ്.മോർഫോജെനിസിസ് ശരിയായി നിയന്ത്രിക്കുന്നതിന് മൈക്രോട്യൂബ്യൂൾ ഡൈനാമിക്‌സ് നിയന്ത്രിക്കുന്നതിലൂടെ സസ്യങ്ങൾ കോർട്ടിക്കൽ മൈക്രോട്യൂബ്യൂൾ ഓർഗനൈസേഷൻ്റെ സങ്കീർണ്ണ സംവിധാനങ്ങൾ വികസിപ്പിച്ചെടുത്തിട്ടുണ്ടെന്ന് മുൻകാല പഠനങ്ങൾ തെളിയിച്ചിട്ടുണ്ട്.മൈക്രോട്യൂബ്യൂൾ പ്രവർത്തനത്തിൻ്റെ നിയന്ത്രണത്തിന് ഉത്തരവാദികളായ ധാരാളം തന്മാത്രകൾ തിരിച്ചറിഞ്ഞിട്ടുണ്ട്, അനുബന്ധ ഗവേഷണങ്ങൾ ഇപ്പോഴും നടന്നുകൊണ്ടിരിക്കുന്നു3,4,28.സസ്യകോശങ്ങളിലെ മൈക്രോട്യൂബ്യൂൾ ഡൈനാമിക്സിനെക്കുറിച്ചുള്ള നമ്മുടെ നിലവിലെ ധാരണ കോർട്ടിക്കൽ മൈക്രോട്യൂബ്യൂൾ ഓർഗനൈസേഷൻ്റെ സംവിധാനങ്ങളെ പൂർണ്ണമായി വിശദീകരിക്കുന്നില്ല.ഉദാഹരണത്തിന്, ഡിസോപിറാമൈഡിനും ഒറിസാലിനും മൈക്രോട്യൂബുളുകളെ ഡിപോളിമറൈസ് ചെയ്യാൻ കഴിയുമെങ്കിലും, ഡിസോപിറാമൈഡിന് കടുത്ത വേരുകൾ വികലമാക്കാൻ കഴിയും, അതേസമയം ഒറിസാലിൻ താരതമ്യേന നേരിയ ഫലമുണ്ടാക്കുന്നു.മാത്രമല്ല, മൈക്രോട്യൂബുളുകളെ സ്ഥിരപ്പെടുത്തുന്ന ട്യൂബുലിനിലെ മ്യൂട്ടേഷനുകൾ വേരുകളിൽ ഡെക്‌സ്ട്രോറോട്ടേഷനും കാരണമാകുന്നു, അതേസമയം മൈക്രോട്യൂബ്യൂൾ ഡൈനാമിക്‌സിനെ സ്ഥിരപ്പെടുത്തുന്ന പാക്ലിറ്റാക്സൽ അങ്ങനെ ചെയ്യുന്നില്ല.അതിനാൽ, ഉർസോളിക് ആസിഡിൻ്റെ തന്മാത്രാ ലക്ഷ്യങ്ങൾ പഠിക്കുകയും തിരിച്ചറിയുകയും ചെയ്യുന്നത് പ്ലാൻ്റ് കോർട്ടിക്കൽ മൈക്രോട്യൂബ്യൂളുകളുടെ നിയന്ത്രണത്തെക്കുറിച്ച് പുതിയ ഉൾക്കാഴ്ചകൾ നൽകണം.അതുപോലെ, വികലമായ വളർച്ചയെ പ്രോത്സാഹിപ്പിക്കുന്നതിൽ ഫലപ്രദമാകുന്ന ഡിസോപിറാമൈഡ് പോലുള്ള രാസവസ്തുക്കളുടെയും ഒറിസാലിൻ അല്ലെങ്കിൽ കുമാമോട്ടോറിക് ആസിഡ് പോലെയുള്ള ഫലപ്രദമല്ലാത്ത രാസവസ്തുക്കളുടെയും ഭാവിയിലെ താരതമ്യങ്ങൾ വികലമായ വളർച്ച എങ്ങനെ സംഭവിക്കുന്നു എന്നതിൻ്റെ സൂചനകൾ നൽകും.
മറുവശത്ത്, പ്രതിരോധവുമായി ബന്ധപ്പെട്ട സൈറ്റോസ്‌കെലെറ്റൽ പുനഃക്രമീകരണങ്ങൾ ഉർസോണിക് ആസിഡിൻ്റെ സൈറ്റോടോക്സിസിറ്റി വിശദീകരിക്കാനുള്ള മറ്റൊരു സാധ്യതയാണ്.ഒരു രോഗകാരിയുടെ അണുബാധ അല്ലെങ്കിൽ സസ്യകോശങ്ങളിലേക്ക് ഒരു എലിസിറ്റർ അവതരിപ്പിക്കുന്നത് ചിലപ്പോൾ സൈറ്റോസ്‌കെലിറ്റൻ്റെ നാശത്തിനും തുടർന്നുള്ള കോശ മരണത്തിനും കാരണമാകുന്നു.ഉദാഹരണത്തിന്, Omycete-derived cryptoxanthin പുകയില കോശങ്ങളുടെ മരണത്തിന് മുമ്പുള്ള മൈക്രോട്യൂബുലുകളേയും ആക്റ്റിൻ ഫിലമെൻ്റുകളേയും തടസ്സപ്പെടുത്തുന്നതായി റിപ്പോർട്ട് ചെയ്യപ്പെട്ടിട്ടുണ്ട്, KAND ചികിത്സ30,31.പ്രതിരോധ പ്രതികരണങ്ങളും ഉർസോണിക് ആസിഡ് പ്രേരിപ്പിച്ച സെല്ലുലാർ പ്രതികരണങ്ങളും തമ്മിലുള്ള സാമ്യം, അവ സാധാരണ സെല്ലുലാർ പ്രക്രിയകൾക്ക് കാരണമാകുമെന്ന് അനുമാനിക്കാൻ ഞങ്ങളെ പ്രേരിപ്പിച്ചു, എന്നിരുന്നാലും ക്രിപ്‌റ്റോക്‌സാന്തിനേക്കാൾ വേഗതയേറിയതും ശക്തവുമായ ഉർസോണിക് ആസിഡിൻ്റെ പ്രഭാവം പ്രകടമാണ്.എന്നിരുന്നാലും, ആക്റ്റിൻ ഫിലമെൻ്റുകളുടെ തടസ്സം സ്വയമേവയുള്ള കോശ മരണത്തെ പ്രോത്സാഹിപ്പിക്കുന്നുവെന്ന് പഠനങ്ങൾ തെളിയിച്ചിട്ടുണ്ട്, ഇത് എല്ലായ്പ്പോഴും മൈക്രോട്യൂബ്യൂൾ തടസ്സത്തോടൊപ്പം ഉണ്ടാകില്ല.കൂടാതെ, ഉർസോണിക് ആസിഡിൻ്റെ ഡെറിവേറ്റീവുകൾ ചെയ്യുന്നതുപോലെ, രോഗകാരിയോ എലിസിറ്ററോ വികലമായ വേരുകളുടെ വളർച്ചയ്ക്ക് കാരണമാകുമോ എന്ന് പരിശോധിക്കേണ്ടതുണ്ട്.അതിനാൽ, പ്രതിരോധ പ്രതികരണങ്ങളെയും സൈറ്റോസ്‌കെലിറ്റണിനെയും ബന്ധിപ്പിക്കുന്ന തന്മാത്രാ അറിവ് അഭിസംബോധന ചെയ്യേണ്ട ആകർഷകമായ പ്രശ്‌നമാണ്.ഉർസോണിക് ആസിഡുമായി ബന്ധപ്പെട്ട ലോ മോളിക്യുലാർ വെയ്റ്റ് സംയുക്തങ്ങളുടെയും വ്യത്യസ്ത ശക്തികളുള്ള ഡെറിവേറ്റീവുകളുടെ ഒരു ശ്രേണിയുടെയും സാന്നിധ്യം ചൂഷണം ചെയ്യുന്നതിലൂടെ, അജ്ഞാത സെല്ലുലാർ മെക്കാനിസങ്ങളെ ടാർഗെറ്റുചെയ്യാൻ അവ അവസരങ്ങൾ നൽകിയേക്കാം.
ഒന്നിച്ചു നോക്കിയാൽ, മൈക്രോട്യൂബ്യൂൾ ഡൈനാമിക്‌സ് മോഡുലേറ്റ് ചെയ്യുന്ന പുതിയ സംയുക്തങ്ങളുടെ കണ്ടെത്തലും പ്രയോഗവും പ്ലാൻ്റ് സെൽ ആകൃതി നിർണ്ണയത്തിന് അടിസ്ഥാനമായ സങ്കീർണ്ണമായ തന്മാത്രാ സംവിധാനങ്ങളെ അഭിസംബോധന ചെയ്യാൻ ശക്തമായ രീതികൾ നൽകും.ഈ സാഹചര്യത്തിൽ, അടുത്തിടെ വികസിപ്പിച്ച സംയുക്തമായ ഉർമോട്ടോണിക് ആസിഡ്, മൈക്രോട്യൂബുലുകളേയും ആക്റ്റിൻ ഫിലമെൻ്റുകളേയും ബാധിക്കുകയും കോശങ്ങളുടെ മരണത്തിന് പ്രേരിപ്പിക്കുകയും ചെയ്യുന്നു, ഇത് മൈക്രോട്യൂബ്യൂൾ നിയന്ത്രണവും ഈ മറ്റ് സംവിധാനങ്ങളും തമ്മിലുള്ള ബന്ധം മനസ്സിലാക്കാൻ അവസരം നൽകിയേക്കാം.അതിനാൽ, ഉർബെനോണിക് ആസിഡ് ഉപയോഗിച്ചുള്ള രാസ, ജൈവ വിശകലനം സസ്യ സൈറ്റോസ്‌കെലിറ്റണിനെ നിയന്ത്രിക്കുന്ന തന്മാത്രാ നിയന്ത്രണ സംവിധാനങ്ങൾ മനസ്സിലാക്കാൻ സഹായിക്കും.
2% (w/v) ഗാലക്ടോസ്, 2% (w/v) എസ്സെൻസ് പേസ്റ്റ്, 1% (w/v) ബാക്റ്റോ കോമ്പോസിഷൻ അടങ്ങിയ 110 മില്ലി വിത്ത് മീഡിയം അടങ്ങുന്ന 500 എം.എൽ. .-soyton (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0.5% (w/v) ധാന്യ സത്തിൽ (KOGOSTCH Co., Ltd., Japan), 0.2% (w/v) (NH4) 2SO4, 0.2% CaCO3 എന്നിവ ഡീയോണൈസ്ഡ് വെള്ളത്തിൽ.(വന്ധ്യംകരണത്തിന് മുമ്പ് pH 7.4).വിത്ത് കൾച്ചറുകൾ ഒരു റോട്ടറി ഷേക്കറിൽ (180 ആർപിഎം) 27 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ 2 ദിവസത്തേക്ക് ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്തു.ഖരാവസ്ഥയിലുള്ള അഴുകൽ വഴിയുള്ള ഉൽപാദന കൃഷി.15 ഗ്രാം പ്രെസ്ഡ് ബാർലിയും (MUSO Co., Ltd., Japan) 25 ഗ്രാം ഡീയോണൈസ്ഡ് വെള്ളവും (pH ക്രമീകരിച്ചിട്ടില്ല) അടങ്ങിയ 40 ഗ്രാം ഉൽപ്പാദന മാധ്യമം അടങ്ങിയ 500 മില്ലി K-1 ഫ്ലാസ്കിലേക്ക് വിത്ത് കൾച്ചർ (7 മില്ലി) മാറ്റി. വന്ധ്യംകരണത്തിന് മുമ്പ്).).14 ദിവസം ഇരുട്ടിൽ 30 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ അഴുകൽ നടത്തി.അഴുകൽ മെറ്റീരിയൽ 40 മില്ലി / ബോട്ടിൽ EtOH ഉപയോഗിച്ച് വേർതിരിച്ചെടുക്കുകയും സെൻട്രിഫ്യൂജ് ചെയ്യുകയും ചെയ്തു (1500 ഗ്രാം, 4 ° C, 10 മിനിറ്റ്).കൾച്ചർ സൂപ്പർനാറ്റൻ്റ് (60 മില്ലി) 10% MeOH/EtOAc മിശ്രിതം ഉപയോഗിച്ച് വേർതിരിച്ചെടുത്തു.ഒരു റിവേഴ്‌സ് ഫേസ് കോളത്തിൽ (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID) ഗ്രേഡിയൻ്റ് എല്യൂഷൻ (0-10 മിനിറ്റ്: 90%) ഉപയോഗിച്ച് HPLC-ന് വിധേയമാക്കിയ ഒരു അവശിഷ്ടം (59.5 mg) ലഭിക്കുന്നതിന് ഓർഗാനിക് പാളി കുറഞ്ഞ സമ്മർദ്ദത്തിൽ ബാഷ്പീകരിക്കപ്പെട്ടു. 10 mm × നീളം 250 mm) H2O/CH3CN, 10-35 മിനിറ്റ്: 90% H2O/CH3CN മുതൽ 70% H2O/CH3CN (ഗ്രേഡിയൻ്റ്), 35-45 മിനിറ്റ്: 90% H2O/EtOH, 45-155 മിനിറ്റ്: 90% H2O /EtOH മുതൽ 100% EtOH (ഗ്രേഡിയൻ്റ് (ഗ്രേഡിയൻ്റ്), 155-200 മിനിറ്റ്: 100% EtOH) 1.5 മില്ലി/മിനിറ്റ് ഫ്ലോ റേറ്റിൽ, coumamonamide (1, 36.0 mg) ഒരു വെളുത്ത രൂപരഹിതമായ പൊടിയായി വേർതിരിച്ചു.
കുമാമോട്ടോമൈഡ്(1);1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6.93 (t, J = 2.5 Hz, 1H), 6.76 (dd, J = 4.3, 1.8 Hz 1H), 6.05 (t , J = 3.8 Hz, 1H).), 4.08 (s, 3H);13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161.1, 121.0, 119.9, 112.2, 105.0, 68.3;ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ കണക്കാക്കിയ മൂല്യം: 141.0659, അളന്ന മൂല്യം: 141.0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 15393, 15973 സെ.മീ.
ഗവേഷണ ഉപയോഗത്തിനുള്ള അനുമതിയോടെ അറബിഡോപ്സിസ് ബയോളജിക്കൽ റിസോഴ്സ് സെൻ്ററിൽ (ABRC) നിന്ന് കൊളംബിയ വിത്തുകൾ (Col-0) ലഭിച്ചു.Col-0 വിത്തുകൾ ഞങ്ങളുടെ ലബോറട്ടറി സാഹചര്യങ്ങളിൽ പ്രചരിപ്പിച്ച് പരിപാലിക്കുകയും കാട്ടു-തരം അറബിഡോപ്സിസ് സസ്യങ്ങളായി ഉപയോഗിക്കുകയും ചെയ്തു.2% സുക്രോസ് (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0.05% (w/v) 2-(4-morpholino) ethanesulfonic acid (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical) അടങ്ങിയ അർദ്ധവീര്യമുള്ള മുരാഷിഗെ, സ്കൂഗ് മീഡിയം എന്നിവയിൽ അറബിഡോപ്സിസ് വിത്തുകൾ ഉപരിതല അണുവിമുക്തമാക്കുകയും സംസ്ക്കരിക്കുകയും ചെയ്തു. ).) കൂടാതെ 1.5% അഗർ (ഫ്യൂജിഫിലിം വാക്കോ പ്യുവർ കെമിക്കൽ), pH 5.7, 23 °C, സ്ഥിരമായ പ്രകാശം.ടി. ഹാഷിമോട്ടോ (നാര ഇൻസ്റ്റിറ്റ്യൂട്ട് ഓഫ് സയൻസ് ആൻഡ് ടെക്നോളജി) ആണ് phs1-1 മ്യൂട്ടൻ്റിൻറെ വിത്തുകൾ നൽകിയത്.
ടി. ഹാഷിമോട്ടോ (നാര ഇൻസ്റ്റിറ്റ്യൂട്ട് ഓഫ് സയൻസ് ആൻഡ് ടെക്‌നോളജി) SR-1 എന്ന സ്‌ട്രെയിനിൻ്റെ വിത്തുകൾ നൽകി, കാട്ടുതരം പുകയില ചെടികളായി ഉപയോഗിച്ചു.പുകയില വിത്തുകൾ ഉപരിതല അണുവിമുക്തമാക്കുകയും അണുവിമുക്തമായ വെള്ളത്തിൽ മൂന്ന് രാത്രി മുക്കിവയ്ക്കുകയും ചെയ്തു, തുടർന്ന് 2% സുക്രോസ്, 0.05% (w/v) MES, 0.8% gellan gum (Fujifilm Wako Pure Chemical) എന്നിവ അടങ്ങിയ അർദ്ധവീര്യമുള്ള ലായനിയിൽ സ്ഥാപിച്ചു. മുരാഷിഗെ.കൂടാതെ സ്‌കൂഗ് മീഡിയം) pH 5.7 ഉള്ളതും സ്ഥിരമായ വെളിച്ചത്തിൽ 23°C താപനിലയിൽ ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്യപ്പെടുന്നതുമാണ്.
സ്‌ട്രെയിൻ ടാക്-1 നൽകിയത് ടി.കൊച്ചി (ക്യോട്ടോ യൂണിവേഴ്‌സിറ്റി) ആണ്, ലിവർവോർട്ട് പഠനത്തിനുള്ള സ്റ്റാൻഡേർഡ് പരീക്ഷണ യൂണിറ്റായി ഇത് ഉപയോഗിച്ചു.അണുവിമുക്തമാക്കിയ കൾച്ചർ ചെയ്ത ചെടികളിൽ നിന്നാണ് ജെമ്മ ലഭിച്ചത്, തുടർന്ന് 1% സുക്രോസും 0.3% ജെല്ലൻ ഗമ്മും അടങ്ങിയ ഗാംബോർഗ് ബി5 മീഡിയത്തിൽ (ഫ്യൂജിഫിലിം വാക്കോ പ്യുവർ കെമിക്കൽ) പൂശുകയും തുടർച്ചയായ വെളിച്ചത്തിൽ 23 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്യുകയും ചെയ്തു.
Tobacco BY-2 സെല്ലുകൾ (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) നൽകിയത് S. Hasezawa (ടോക്കിയോ യൂണിവേഴ്സിറ്റി) ആണ്.BY-2 സെല്ലുകൾ പരിഷ്‌ക്കരിച്ച ലിൻസ്‌മിയർ, സ്‌കൂഗ് മീഡിയത്തിൽ 95 മടങ്ങ് നേർപ്പിക്കുകയും 2,4-ഡൈക്ലോറോഫെനോക്‌സിയാസെറ്റിക് ആസിഡ് 32 ഉപയോഗിച്ച് ആഴ്ചതോറും നൽകുകയും ചെയ്തു.ഇരുട്ടിൽ 27 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ 130 ആർപിഎമ്മിൽ ഒരു റോട്ടറി ഷേക്കറിൽ സെൽ സസ്പെൻഷൻ കലർത്തി.പുതിയ മീഡിയത്തിൻ്റെ 10 മടങ്ങ് വോളിയം ഉപയോഗിച്ച് സെല്ലുകൾ കഴുകുക, അതേ മീഡിയത്തിൽ വീണ്ടും സസ്പെൻഡ് ചെയ്യുക.മൈക്രോട്യൂബ്യൂൾ മാർക്കർ TagRFP-TUA6 അല്ലെങ്കിൽ കോളിഫ്‌ളവർ മൊസൈക് വൈറസ് 35S പ്രൊമോട്ടറിന് കീഴിലുള്ള ആക്ടിൻ ഫിലമെൻ്റ് മാർക്കർ GFP-ABD2 എന്നിവ സ്ഥിരമായി പ്രകടിപ്പിക്കുന്ന BY-2 ട്രാൻസ്ജെനിക് സെൽ ലൈനുകൾ വിവരിച്ചിരിക്കുന്നതുപോലെ ജനറേറ്റുചെയ്‌തു.യഥാർത്ഥ BY-2 സെൽ ലൈനിന് ഉപയോഗിച്ചതിന് സമാനമായ നടപടിക്രമങ്ങൾ ഉപയോഗിച്ച് ഈ സെൽ ലൈനുകൾ നിലനിർത്താനും സമന്വയിപ്പിക്കാനും കഴിയും.
37°C ഇൻക്യുബേറ്ററിൽ 10% ഫീറ്റൽ ബോവിൻ സെറം, 1.2 U/ml പെൻസിലിൻ, 1.2 μg/ml സ്ട്രെപ്റ്റോമൈസിൻ, 37°C ഇൻക്യുബേറ്ററിൽ 1.2 μg/ml സ്ട്രെപ്റ്റോമൈസിൻ എന്നിവയ്‌ക്കൊപ്പം ഡൽബെക്കോയുടെ പരിഷ്‌ക്കരിച്ച ഈഗിൾസ് മീഡിയത്തിൽ (DMEM) (ലൈഫ് ടെക്‌നോളജീസ്) HeLa കോശങ്ങൾ സംസ്‌കരിക്കപ്പെട്ടു.
ഈ കൈയെഴുത്തുപ്രതിയിൽ വിവരിച്ചിരിക്കുന്ന എല്ലാ പരീക്ഷണങ്ങളും ജാപ്പനീസ് ബയോ സേഫ്റ്റി റെഗുലേഷനുകളും മാർഗ്ഗനിർദ്ദേശങ്ങളും അനുസരിച്ചാണ് നടത്തിയത്.
സംയുക്തങ്ങൾ ഡൈമെഥൈൽ സൾഫോക്സൈഡിൽ (ഡിഎംഎസ്ഒ; ഫ്യൂജിഫിലിം വാക്കോ പ്യുവർ കെമിക്കൽ) ലയിപ്പിച്ച് സ്റ്റോക്ക് ലായനികളായി എംഎസ് മീഡിയത്തിൽ ലയിപ്പിച്ചു, അറബിഡോപ്സിസ്, പുകയില അല്ലെങ്കിൽ ലിവർവോർട്ടിനായി ഗാംബോർഗ് ബി5 മീഡിയം.റൂട്ട് ഗ്രോത്ത് ഇൻഹിബിഷൻ അസ്സെയ്‌ക്കായി, സൂചിപ്പിച്ച സംയുക്തങ്ങൾ അല്ലെങ്കിൽ ഡിഎംഎസ്ഒ അടങ്ങിയ അഗർ മീഡിയത്തിൽ ഒരു പ്ലേറ്റിൽ 10-ൽ കൂടുതൽ വിത്തുകൾ പാകി.വിത്തുകൾ വളർച്ചാ മുറിയിൽ 7 ദിവസത്തേക്ക് ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്തു.തൈകളുടെ ഫോട്ടോ എടുക്കുകയും വേരുകളുടെ നീളം അളക്കുകയും ചെയ്തു.അറബിഡോപ്സിസ് മുളപ്പിക്കൽ പരിശോധനയ്ക്കായി, 200 μM സംയുക്തം അല്ലെങ്കിൽ ഡിഎംഎസ്ഒ അടങ്ങിയ അഗർ മീഡിയത്തിൽ ഒരു പ്ലേറ്റിൽ 48 വിത്തുകൾ പാകി.ഒരു ഗ്രോത്ത് ചേമ്പറിൽ അറബിഡോപ്സിസ് വിത്തുകൾ വളർത്തി, മുളച്ച് 7 ദിവസം കഴിഞ്ഞ് (ഡാഗ്) മുളപ്പിച്ച തൈകളുടെ എണ്ണം കണക്കാക്കി.പുകയില മുളയ്ക്കുന്നതിനുള്ള പരിശോധനയ്ക്കായി, 200 μM KAND അല്ലെങ്കിൽ DMSO അടങ്ങിയ അഗർ മീഡിയത്തിൽ ഒരു പ്ലേറ്റിൽ 24 വിത്തുകൾ പാകി.ഒരു ഗ്രോത്ത് ചേമ്പറിൽ പുകയില വിത്തുകൾ വളർത്തി, 14 ദിവസത്തിന് ശേഷം മുളപ്പിച്ച തൈകളുടെ എണ്ണം കണക്കാക്കി.ലിവർവോർട്ട് വളർച്ച തടയുന്നതിനുള്ള പരിശോധനയ്ക്കായി, ഓരോ പ്ലേറ്റിൽ നിന്നുമുള്ള 9 ഭ്രൂണങ്ങൾ KAND അല്ലെങ്കിൽ DMSO യുടെ സൂചിപ്പിച്ച സാന്ദ്രത അടങ്ങിയ അഗർ മീഡിയത്തിൽ പൂശുകയും 14 ദിവസത്തേക്ക് വളർച്ചാ മുറിയിൽ ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്യുകയും ചെയ്തു.
റൂട്ട് മെറിസ്റ്റം ഓർഗനൈസേഷൻ ദൃശ്യവൽക്കരിക്കുന്നതിന് 5 മില്ലിഗ്രാം/മില്ലി പ്രൊപ്പിഡിയം അയഡൈഡ് (PI) ഉപയോഗിച്ച് സ്റ്റെയിൻ ചെയ്ത തൈകൾ ഉപയോഗിക്കുക.ടിസിഎസ് എസ്പിഇ കൺഫോക്കൽ ലേസർ സ്കാനിംഗ് മൈക്രോസ്കോപ്പ് (ലൈക മൈക്രോസിസ്റ്റംസ്) ഉപയോഗിച്ച് ഫ്ലൂറസെൻസ് മൈക്രോസ്കോപ്പി ഉപയോഗിച്ച് പിഐ സിഗ്നലുകൾ നിരീക്ഷിച്ചു.
Malami, Benfey36 എന്നിവർ വിവരിച്ച പ്രോട്ടോക്കോൾ അനുസരിച്ച് β-glucuronidase (GUS) ഉപയോഗിച്ച് വേരുകളുടെ ഹിസ്റ്റോകെമിക്കൽ സ്റ്റെയിനിംഗ് നടത്തി.തൈകൾ ഒറ്റരാത്രികൊണ്ട് 90% അസെറ്റോണിൽ ഉറപ്പിച്ചു, 0.5 mg/ml 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-d-glucuronic ആസിഡ് ഉപയോഗിച്ച് GUS ബഫറിൽ 1 മണിക്കൂർ നേരം കളഞ്ഞ് ജലാംശമുള്ള ക്ലോറാൾഡിഹൈഡ് ലായനിയിൽ വയ്ക്കുന്നു.(8 ഗ്രാം ക്ലോറൽ ഹൈഡ്രേറ്റ്, 2 മില്ലി വെള്ളം, 1 മില്ലി ഗ്ലിസറോൾ) കൂടാതെ ഒരു ആക്‌സിയോ ഇമേജർ M1 മൈക്രോസ്കോപ്പ് (കാൾ സീസ്) ഉപയോഗിച്ച് ഡിഫറൻഷ്യൽ ഇൻ്റർഫെറൻസ് കോൺട്രാസ്റ്റ് മൈക്രോസ്‌കോപ്പി ഉപയോഗിച്ച് നിരീക്ഷിച്ചു.
ലംബമായി സ്ഥാപിച്ചിരിക്കുന്ന പ്ലേറ്റുകളിൽ വളർത്തിയ 7 ദിവസം പ്രായമുള്ള തൈകളിൽ റൂട്ട് കോണുകൾ അളന്നു.ഘട്ടം 6-ൽ വിവരിച്ചിരിക്കുന്നതുപോലെ ഗ്രാവിറ്റി വെക്‌ടറിൻ്റെ ദിശയിൽ നിന്ന് റൂട്ടിൻ്റെ കോൺ അളക്കുക.
പ്രോട്ടോക്കോൾ 37-ൽ ചെറിയ മാറ്റങ്ങളോടെ, കോർട്ടിക്കൽ മൈക്രോട്യൂബ്യൂളുകളുടെ ക്രമീകരണം വിവരിച്ചതുപോലെ നിരീക്ഷിച്ചു.Anti-β-tubulin antibody (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408), Alexa Fluor 488-conjugated anti-mouse IgG (Thermo Fisher Scientific: A32723) എന്നിവ 1:1000, dilution 1:100 എന്നിവയിൽ പ്രാഥമിക, ദ്വിതീയ ആൻ്റിബോഡികളായി ഉപയോഗിച്ചു. യഥാക്രമം.ഒരു TCS SPE കൺഫോക്കൽ ലേസർ സ്കാനിംഗ് മൈക്രോസ്കോപ്പ് (Leica Microsystems) ഉപയോഗിച്ചാണ് ഫ്ലൂറസെൻസ് ചിത്രങ്ങൾ നേടിയത്.Z- സ്റ്റാക്ക് ഇമേജുകൾ നേടുകയും നിർമ്മാതാവിൻ്റെ നിർദ്ദേശങ്ങൾക്കനുസരിച്ച് പരമാവധി തീവ്രത പ്രൊജക്ഷനുകൾ സൃഷ്ടിക്കുകയും ചെയ്യുക.
നിർമ്മാതാവിൻ്റെ നിർദ്ദേശങ്ങൾ അനുസരിച്ച് സെൽ കൗണ്ടിംഗ് കിറ്റ് 8 (ഡോജിൻഡോ) ഉപയോഗിച്ച് ഹെല സെൽ പ്രൊലിഫെറേഷൻ അസ്സേ നടത്തി.
E. coli DH5α യുടെ വളർച്ച 600 nm-ൽ (OD600) ഒരു സ്പെക്ട്രോഫോട്ടോമീറ്റർ ഉപയോഗിച്ച് സംസ്കാരത്തിലെ സെൽ സാന്ദ്രത അളക്കുന്നതിലൂടെ വിശകലനം ചെയ്തു.
CSU-X1 കൺഫോക്കൽ സ്കാനിംഗ് ഉപകരണവും (യോകോഗാവ) ഒരു sCMOS ക്യാമറയും (Zyla, Andor Technology) സജ്ജീകരിച്ചിട്ടുള്ള ഫ്ലൂറസെൻസ് മൈക്രോസ്കോപ്പ് ഉപയോഗിച്ച് ട്രാൻസ്ജെനിക് BY-2 സെല്ലുകളിലെ സൈറ്റോസ്കെലെറ്റൽ ഓർഗനൈസേഷൻ നിരീക്ഷിച്ചു.ഇമേജ് വിശകലനത്തിലൂടെ സൈറ്റോസ്‌കെലെറ്റൽ സാന്ദ്രത വിലയിരുത്തി, വിവരിച്ചിരിക്കുന്നതുപോലെ ഇമേജ് ജെ സോഫ്റ്റ്‌വെയർ ഉപയോഗിച്ച് കോൺഫോക്കൽ ചിത്രങ്ങളിലെ സൈറ്റോസ്‌കെലെറ്റൽ പിക്‌സലുകൾക്കിടയിൽ സൈറ്റോസ്‌കെലെറ്റൽ പിക്‌സലുകളുടെ ശതമാനം കണക്കാക്കുന്നു.
BY-2 കോശങ്ങളിലെ കോശമരണം കണ്ടെത്തുന്നതിന്, സെൽ സസ്പെൻഷൻ്റെ ഒരു അലിഖോട്ട് 0.05% ഇവാൻസ് ബ്ലൂ ഉപയോഗിച്ച് 10 മിനിറ്റ് ഊഷ്മാവിൽ ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്തു.നിർജ്ജീവ കോശങ്ങളുടെ സെലക്ടീവ് ഇവാൻസ് ബ്ലൂ സ്റ്റെയിനിംഗ് പ്ലാസ്മ മെംബ്രൺ വഴി പ്രവർത്തനക്ഷമമായ കോശങ്ങളിൽ നിന്ന് ചായം പുറത്തെടുക്കുന്നതിനെ ആശ്രയിച്ചിരിക്കുന്നു.ഒരു ബ്രൈറ്റ്-ഫീൽഡ് മൈക്രോസ്കോപ്പ് (BX53, ഒളിമ്പസ്) ഉപയോഗിച്ച് സ്റ്റെയിൻഡ് സെല്ലുകൾ നിരീക്ഷിച്ചു.
37 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിലും 5% CO2 ലും ഹ്യുമിഡിഫൈഡ് ഇൻകുബേറ്ററിൽ 10% FBS അനുബന്ധമായി DMEM-ൽ HeLa സെല്ലുകൾ വളർന്നു.കോശങ്ങളെ 100 μM KAND 11, kumamonamic ആസിഡ് 6, kumamonamide 1, 100 ng/ml colcemid (Gibco), അല്ലെങ്കിൽ 100 ​​ng/ml Nocodmaze (Sigma) ഉപയോഗിച്ച് 6 മണിക്കൂർ 37 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ ചികിത്സിച്ചു.സെല്ലുകൾ 10 മിനിറ്റ് MetOH ഉപയോഗിച്ചും തുടർന്ന് 5 മിനിറ്റ് അസറ്റേറ്റ് ഉപയോഗിച്ചും ഊഷ്മാവിൽ ഉറപ്പിച്ചു.ഫിക്സഡ് സെല്ലുകൾ β-tubulin പ്രൈമറി ആൻ്റിബോഡി (1D4A4, Proteintech: 66240-1) ഉപയോഗിച്ച് 0.5% BSA/PBS-ൽ 2 മണിക്കൂർ നേർപ്പിച്ച്, TBST ഉപയോഗിച്ച് 3 തവണ കഴുകി, തുടർന്ന് Alexa Fluor ആട് ആൻ്റിബോഡി ഉപയോഗിച്ച് ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്തു.488 1 മണിക്കൂർ.– മൗസ് IgG (തെർമോ ഫിഷർ സയൻ്റിഫിക്: A11001), 15 ng/ml 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) എന്നിവ 0.5% BSA/PBS-ൽ ലയിപ്പിച്ചതാണ്.ടിബിഎസ്ടി ഉപയോഗിച്ച് മൂന്ന് തവണ കഴുകിയ ശേഷം, നിക്കോൺ എക്ലിപ്സ് Ti-E വിപരീത മൈക്രോസ്കോപ്പിൽ സ്റ്റെയിൻഡ് സെല്ലുകൾ നിരീക്ഷിച്ചു.മെറ്റാമോർഫ് സോഫ്‌റ്റ്‌വെയർ (മോളിക്യുലർ ഡിവൈസുകൾ) ഉപയോഗിച്ച് തണുപ്പിച്ച ഹമാമത്സു ORCA-R2 CCD ക്യാമറ ഉപയോഗിച്ചാണ് ചിത്രങ്ങൾ പകർത്തിയത്.