Nature.com സന്ദർശിച്ചതിന് നന്ദി. നിങ്ങൾ ഉപയോഗിക്കുന്ന ബ്രൗസറിന്റെ പതിപ്പിന് പരിമിതമായ CSS പിന്തുണ മാത്രമേ ഉള്ളൂ. മികച്ച ഫലങ്ങൾക്കായി, നിങ്ങളുടെ ബ്രൗസറിന്റെ പുതിയ പതിപ്പ് ഉപയോഗിക്കാൻ ഞങ്ങൾ ശുപാർശ ചെയ്യുന്നു (അല്ലെങ്കിൽ ഇന്റർനെറ്റ് എക്സ്പ്ലോററിൽ കോംപാറ്റിബിലിറ്റി മോഡ് പ്രവർത്തനരഹിതമാക്കുക). അതേസമയം, തുടർച്ചയായ പിന്തുണ ഉറപ്പാക്കാൻ, സ്റ്റൈലിംഗോ ജാവാസ്ക്രിപ്റ്റോ ഇല്ലാതെ ഞങ്ങൾ സൈറ്റ് കാണിക്കുന്നു.
പ്രകൃതിദത്ത ഉൽപ്പന്നങ്ങളുടെ കണ്ടെത്തലും പ്രയോജനകരമായ ഉപയോഗവും മനുഷ്യജീവിതം മെച്ചപ്പെടുത്താൻ സഹായിക്കും. കളകളെ നിയന്ത്രിക്കുന്നതിന് സസ്യവളർച്ചയെ തടസ്സപ്പെടുത്തുന്ന രാസവസ്തുക്കൾ കളനാശിനികളായി വ്യാപകമായി ഉപയോഗിക്കുന്നു. വ്യത്യസ്ത തരം കളനാശിനികൾ ഉപയോഗിക്കേണ്ടതിന്റെ ആവശ്യകത കാരണം, പുതിയ പ്രവർത്തന സംവിധാനങ്ങളുള്ള സംയുക്തങ്ങൾ തിരിച്ചറിയേണ്ടതുണ്ട്. ഈ പഠനത്തിൽ, സ്ട്രെപ്റ്റോമൈസസ് വെറൻസിസ് MK493-CF1 ൽ നിന്ന് ഒരു പുതിയ N-alkoxypyrrole സംയുക്തം, coumamonamide ഞങ്ങൾ കണ്ടെത്തി, പൂർണ്ണമായ സിന്തസിസ് പ്രക്രിയ സ്ഥാപിച്ചു. ജൈവിക പ്രവർത്തന പരിശോധനകളിലൂടെ, urs-monoamic ആസിഡ് urs-monoamide ന്റെ ഒരു സിന്തറ്റിക് ഇന്റർമീഡിയറ്റാണെന്നും ഒരു സാധ്യതയുണ്ടെന്നും ഞങ്ങൾ കണ്ടെത്തി.സസ്യവളർച്ച തടസ്സപ്പെടുത്തുന്നവ. കൂടാതെ, HeLa കോശങ്ങളുടെ വളർച്ചയെ പ്രതികൂലമായി ബാധിക്കാതെ ഉയർന്ന കളനാശിനി പ്രവർത്തനം ഉള്ള ഉർബെനിലോക്സി ഡെറിവേറ്റീവ് (UDA) ഉൾപ്പെടെയുള്ള വിവിധ ഉർബെനോണിക് ആസിഡ് ഡെറിവേറ്റീവുകൾ ഞങ്ങൾ വികസിപ്പിച്ചെടുത്തിട്ടുണ്ട്. ഉർമോട്ടോണിക് ആസിഡ് ഡെറിവേറ്റീവുകൾ സസ്യ മൈക്രോട്യൂബ്യൂളുകളെ തടസ്സപ്പെടുത്തുന്നുവെന്നും ഞങ്ങൾ കണ്ടെത്തി; കൂടാതെ, KAND ആക്റ്റിൻ ഫിലമെന്റുകളെ ബാധിക്കുകയും കോശ മരണത്തിന് കാരണമാവുകയും ചെയ്യുന്നു; ഈ ബഹുമുഖ ഫലങ്ങൾ അറിയപ്പെടുന്ന മൈക്രോട്യൂബ്യൂൾ ഇൻഹിബിറ്ററുകളിൽ നിന്ന് വ്യത്യസ്തമാണ്, കൂടാതെ പുതിയ കളനാശിനികളുടെ വികസനത്തിൽ ഒരു പ്രധാന നേട്ടത്തെ പ്രതിനിധീകരിക്കുന്ന ഉർസോണിക് ആസിഡിനുള്ള ഒരു പുതിയ പ്രവർത്തന സംവിധാനം നിർദ്ദേശിക്കുന്നു.
പ്രയോജനകരമായ പ്രകൃതിദത്ത ഉൽപ്പന്നങ്ങളുടെയും അവയുടെ ഡെറിവേറ്റീവുകളുടെയും കണ്ടെത്തലും പ്രായോഗിക പ്രയോഗവും മനുഷ്യജീവിതത്തിന്റെ ഗുണനിലവാരം മെച്ചപ്പെടുത്തുന്നതിനുള്ള ഒരു മാർഗമാണ്. സൂക്ഷ്മാണുക്കൾ, സസ്യങ്ങൾ, പ്രാണികൾ എന്നിവയാൽ ഉത്പാദിപ്പിക്കപ്പെടുന്ന ദ്വിതീയ മെറ്റബോളിറ്റുകൾ വൈദ്യശാസ്ത്രത്തിലും കൃഷിയിലും വലിയ പുരോഗതിക്ക് കാരണമായിട്ടുണ്ട്. പ്രകൃതിദത്ത ഉൽപ്പന്നങ്ങളിൽ നിന്ന് നിരവധി ആൻറിബയോട്ടിക്കുകളും രക്താർബുദ വിരുദ്ധ മരുന്നുകളും വികസിപ്പിച്ചെടുത്തിട്ടുണ്ട്. കൂടാതെ, വിവിധ തരംകീടനാശിനികൾ, കൃഷിയിൽ ഉപയോഗിക്കുന്നതിനായി ഈ പ്രകൃതിദത്ത ഉൽപ്പന്നങ്ങളിൽ നിന്ന് കുമിൾനാശിനികളും കളനാശിനികളും വേർതിരിച്ചെടുക്കുന്നു. പ്രത്യേകിച്ച്, ആധുനിക കൃഷിയിൽ വിള വിളവ് വർദ്ധിപ്പിക്കുന്നതിനുള്ള പ്രധാന ഉപകരണങ്ങളാണ് കള നിയന്ത്രണ കളനാശിനികൾ, കൂടാതെ വിവിധ തരം സംയുക്തങ്ങൾ ഇതിനകം വാണിജ്യപരമായി ഉപയോഗിച്ചുവരുന്നു. ഫോട്ടോസിന്തസിസ്, അമിനോ ആസിഡ് മെറ്റബോളിസം, സെൽ വാൾ സിന്തസിസ്, മൈറ്റോസിസ് നിയന്ത്രണം, ഫൈറ്റോഹോർമോൺ സിഗ്നലിംഗ് അല്ലെങ്കിൽ പ്രോട്ടീൻ സിന്തസിസ് തുടങ്ങിയ സസ്യങ്ങളിലെ നിരവധി കോശ പ്രക്രിയകൾ കളനാശിനികളുടെ സാധാരണ ലക്ഷ്യങ്ങളായി കണക്കാക്കപ്പെടുന്നു. മൈക്രോട്യൂബ്യൂൾ പ്രവർത്തനത്തെ തടയുന്ന സംയുക്തങ്ങൾ മൈറ്റോട്ടിക് നിയന്ത്രണത്തെ ബാധിച്ചുകൊണ്ട് സസ്യവളർച്ചയെ ബാധിക്കുന്ന ഒരു സാധാരണ കളനാശിനി വിഭാഗമാണ്.
സൈറ്റോസ്കെലിറ്റണിന്റെ ഘടകങ്ങളാണ് മൈക്രോട്യൂബ്യൂളുകൾ, യൂക്കറിയോട്ടിക് കോശങ്ങളിൽ ഇവ വ്യാപകമായി സംരക്ഷിക്കപ്പെടുന്നു. ട്യൂബുലിൻ ഹെറ്ററോഡൈമറിൽ α-ട്യൂബുലിൻ, β-ട്യൂബുലിൻ എന്നിവ ലീനിയർ മൈക്രോട്യൂബ്യൂൾ പ്രോട്ടോഫിലമെന്റുകൾ രൂപപ്പെടുത്തുന്നു, 13 പ്രോട്ടോഫിലമെന്റുകൾ ഒരു സിലിണ്ടർ ഘടന സൃഷ്ടിക്കുന്നു. സസ്യകോശങ്ങളിൽ കോശത്തിന്റെ ആകൃതി, കോശവിഭജനം, ഇൻട്രാ സെല്ലുലാർ ഗതാഗതം എന്നിവ നിർണ്ണയിക്കുന്നതുൾപ്പെടെ മൈക്രോട്യൂബ്യൂളുകൾ ഒന്നിലധികം പങ്ക് വഹിക്കുന്നു. സസ്യകോശങ്ങളിൽ ഇന്റർഫേസ് പ്ലാസ്മ മെംബ്രണിന് താഴെ മൈക്രോട്യൂബ്യൂളുകൾ അടങ്ങിയിരിക്കുന്നു, കൂടാതെ കോർട്ടിക്കൽ മൈക്രോട്യൂബ്യൂളുകൾ എന്ന് വിളിക്കപ്പെടുന്നവ സെല്ലുലോസ് സിന്തേസ് കോംപ്ലക്സുകളുടെ നിയന്ത്രണത്തിലൂടെ സെല്ലുലോസ് മൈക്രോഫിബ്രിലുകളുടെ ഓർഗനൈസേഷനെ നിയന്ത്രിക്കുമെന്ന് കരുതപ്പെടുന്നു. വേരിന്റെ അഗ്രത്തിന്റെ ദ്രുതഗതിയിലുള്ള നീളത്തിന്റെ മേഖലയിൽ കാണപ്പെടുന്ന റൂട്ട് എപ്പിഡെർമൽ കോശങ്ങളുടെ കോർട്ടിക്കൽ മൈക്രോട്യൂബ്യൂളുകൾ പാർശ്വസ്ഥമായി സ്ഥിതിചെയ്യുന്നു, സെല്ലുലോസ് മൈക്രോഫൈബറുകൾ ഈ മൈക്രോട്യൂബ്യൂളുകളെ പിന്തുടരുകയും കോശ വികാസത്തിന്റെ ദിശ പരിമിതപ്പെടുത്തുകയും അതുവഴി അനിസോട്രോപിക് സെൽ നീളം പ്രോത്സാഹിപ്പിക്കുകയും ചെയ്യുന്നു. അതിനാൽ, മൈക്രോട്യൂബ്യൂൾ പ്രവർത്തനം സസ്യ രൂപഘടനയുമായി അടുത്ത ബന്ധപ്പെട്ടിരിക്കുന്നു. ട്യൂബുലിൻ എൻകോഡ് ചെയ്യുന്ന ജീനുകളിലെ അമിനോ ആസിഡ് പകരക്കാർ കോർട്ടിക്കൽ മൈക്രോട്യൂബ്യൂൾ ശ്രേണികളുടെ ചരിവിനും അറബിഡോപ്സിസ് 6,7 ലെ ഇടത് അല്ലെങ്കിൽ വലത് വശങ്ങളിലെ വളർച്ചയ്ക്കും കാരണമാകുന്നു. അതുപോലെ, മൈക്രോട്യൂബ്യൂൾ ഡൈനാമിക്സിനെ നിയന്ത്രിക്കുന്ന മൈക്രോട്യൂബ്യൂളുമായി ബന്ധപ്പെട്ട പ്രോട്ടീനുകളിലെ മ്യൂട്ടേഷനുകളും വികലമായ വേരുകളുടെ വളർച്ചയ്ക്ക് കാരണമാകും8,9,10,11,12,13. കൂടാതെ, പ്രീറ്റിലാക്ലോർ എന്നും അറിയപ്പെടുന്ന ഡിസോപിറാമൈഡ് പോലുള്ള മൈക്രോട്യൂബ്യൂളുകളെ തടസ്സപ്പെടുത്തുന്ന കളനാശിനികൾ ഉപയോഗിച്ചുള്ള ചികിത്സയും ഇടത് വശത്തുള്ള ചരിഞ്ഞ വേരുകളുടെ വളർച്ചയ്ക്ക് കാരണമാകുന്നു14. സസ്യവളർച്ചയുടെ ദിശ നിർണ്ണയിക്കുന്നതിന് മൈക്രോട്യൂബ്യൂൾ പ്രവർത്തനത്തിന്റെ കൃത്യമായ നിയന്ത്രണം നിർണായകമാണെന്ന് ഈ ഡാറ്റ സൂചിപ്പിക്കുന്നു.
വിവിധ തരം മൈക്രോട്യൂബ്യൂൾ ഇൻഹിബിറ്ററുകൾ കണ്ടെത്തിയിട്ടുണ്ട്, ഈ മരുന്നുകൾ സൈറ്റോസ്‌കെലിറ്റൽ ഗവേഷണത്തിനും കൃഷിക്കും വൈദ്യശാസ്ത്രത്തിനും ഗണ്യമായ സംഭാവനകൾ നൽകിയിട്ടുണ്ട്. പ്രത്യേകിച്ച്, ഓറിസാലിൻ, ഡൈനിട്രോഅനിലിൻ സംയുക്തങ്ങൾ, ഡിസോപിറാമൈഡ്, ബെൻസാമൈഡുമായി ബന്ധപ്പെട്ട സംയുക്തങ്ങൾ, അവയുടെ അനലോഗുകൾ എന്നിവയ്ക്ക് മൈക്രോട്യൂബ്യൂൾ പ്രവർത്തനത്തെ തടയാനും അതുവഴി സസ്യവളർച്ചയെ തടയാനും കഴിയും. അതിനാൽ, അവ വ്യാപകമായി കളനാശിനികളായി ഉപയോഗിക്കുന്നു. എന്നിരുന്നാലും, മൈക്രോട്യൂബ്യൂളുകൾ സസ്യങ്ങളുടെയും ജന്തുക്കളുടെയും കോശങ്ങളുടെ ഒരു പ്രധാന ഘടകമായതിനാൽ, മിക്ക മൈക്രോട്യൂബ്യൂൾ ഇൻഹിബിറ്ററുകളും രണ്ട് കോശ തരങ്ങൾക്കും സൈറ്റോടോക്സിക് ആണ്. അതിനാൽ, കളനാശിനികളായി അവയുടെ അംഗീകൃത ഉപയോഗക്ഷമത ഉണ്ടായിരുന്നിട്ടും, പ്രായോഗിക ആവശ്യങ്ങൾക്കായി പരിമിതമായ എണ്ണം ആന്റിമൈക്രോട്യൂബ്യൂൾ ഏജന്റുകൾ ഉപയോഗിക്കുന്നു.
സ്ട്രെപ്റ്റോമൈസിസ് കുടുംബത്തിലെ ഒരു ജനുസ്സാണ് സ്ട്രെപ്റ്റോമൈസിസ്, ഇതിൽ എയറോബിക്, ഗ്രാം പോസിറ്റീവ്, ഫിലമെന്റസ് ബാക്ടീരിയകൾ ഉൾപ്പെടുന്നു, കൂടാതെ വൈവിധ്യമാർന്ന ദ്വിതീയ മെറ്റബോളിറ്റുകൾ ഉത്പാദിപ്പിക്കാനുള്ള കഴിവിന് ഇത് വ്യാപകമായി അറിയപ്പെടുന്നു. അതിനാൽ, പുതിയ ജൈവശാസ്ത്രപരമായി സജീവമായ പ്രകൃതിദത്ത ഉൽപ്പന്നങ്ങളുടെ ഏറ്റവും പ്രധാനപ്പെട്ട സ്രോതസ്സുകളിൽ ഒന്നായി ഇത് കണക്കാക്കപ്പെടുന്നു. നിലവിലെ പഠനത്തിൽ, സ്ട്രെപ്റ്റോമൈസിസ് വെറേൻസിസ് MK493-CF1, S. വെറേൻസിസ് ISP 5486 എന്നിവയിൽ നിന്ന് വേർതിരിച്ചെടുത്ത കൊമമോണമൈഡ് എന്ന പുതിയ സംയുക്തം ഞങ്ങൾ കണ്ടെത്തി. സ്പെക്ട്രൽ വിശകലനവും പൂർണ്ണ സ്പെക്ട്രൽ വിശകലനവും ഉപയോഗിച്ച്, കൊമമോണമൈഡിന്റെ ഘടനയെ വിശേഷിപ്പിക്കുകയും അതിന്റെ അതുല്യമായ N-ആൽക്കോക്സിപൈറോൾ അസ്ഥികൂടം നിർണ്ണയിക്കുകയും ചെയ്തു. സിന്തസിസ്. ഉർസ്മോണോമൈഡിന്റെയും അതിന്റെ ഡെറിവേറ്റീവുകളുടെയും ഒരു സിന്തറ്റിക് ഇന്റർമീഡിയറ്റായ ഉർസ്മോണിക് ആസിഡ്, ജനപ്രിയ മോഡൽ പ്ലാന്റായ അറബിഡോപ്സിസ് താലിയാനയുടെ വളർച്ചയെയും മുളയ്ക്കലിനെയും തടയുന്നതായി കണ്ടെത്തി. ഒരു ഘടന-പ്രവർത്തന ബന്ധ പഠനത്തിൽ, ഉർസോണിക് ആസിഡായി പരിഷ്കരിച്ച C9 ഉള്ള ഒരു സംയുക്തം, ഉർസോണിക് ആസിഡിന്റെ (KAND) നോണിലോക്സി ഡെറിവേറ്റീവ്, വളർച്ചയിലും മുളയ്ക്കലിലും തടസ്സപ്പെടുത്തുന്ന പ്രഭാവം ഗണ്യമായി വർദ്ധിപ്പിക്കുന്നുവെന്ന് ഞങ്ങൾ കണ്ടെത്തി. ശ്രദ്ധേയമായി, പുതുതായി കണ്ടെത്തിയ സസ്യവളർച്ചാ ഇൻഹിബിറ്റർ പുകയിലയുടെയും ലിവർവോർട്ടിന്റെയും വളർച്ചയെ ബാധിച്ചു, ബാക്ടീരിയയ്‌ക്കോ HeLa കോശങ്ങൾക്കോ സൈറ്റോടോക്സിക് ആയിരുന്നില്ല. മാത്രമല്ല, ചില ഉർമോട്ടോണിക് ആസിഡ് ഡെറിവേറ്റീവുകൾ വികലമായ ഒരു റൂട്ട് ഫിനോടൈപ്പിനെ പ്രേരിപ്പിക്കുന്നു, ഇത് സൂചിപ്പിക്കുന്നത് ഈ ഡെറിവേറ്റീവുകൾ നേരിട്ടോ അല്ലാതെയോ മൈക്രോട്യൂബ്യൂളുകളെ ബാധിക്കുന്നു എന്നാണ്. ഈ ആശയത്തിന് അനുസൃതമായി, ഇമ്മ്യൂണോഹിസ്റ്റോകെമിക്കലായോ ഫ്ലൂറസെന്റ് പ്രോട്ടീനുകൾ ഉപയോഗിച്ചോ ലേബൽ ചെയ്‌തിരിക്കുന്ന മൈക്രോട്യൂബ്യൂളുകളെക്കുറിച്ചുള്ള ഞങ്ങളുടെ നിരീക്ഷണങ്ങൾ സൂചിപ്പിക്കുന്നത് KAND ചികിത്സ മൈക്രോട്യൂബ്യൂളുകളെ ഡീപോളിമറൈസ് ചെയ്യുന്നു എന്നാണ്. കൂടാതെ, കുമാമോട്ടോണിക് ആസിഡ് ഡെറിവേറ്റീവുകളുമായുള്ള ചികിത്സ ആക്റ്റിൻ മൈക്രോഫിലമെന്റുകളെ തടസ്സപ്പെടുത്തി. അങ്ങനെ, സൈറ്റോസ്കെലിറ്റണിന്റെ നാശത്തിൽ ഉൾപ്പെടുന്ന ഒരു പുതിയ സസ്യവളർച്ചാ ഇൻഹിബിറ്ററിനെ ഞങ്ങൾ കണ്ടെത്തി, അതിന്റെ സവിശേഷമായ പ്രവർത്തന സംവിധാനം സൈറ്റോസ്കെലിറ്റണിന്റെ നാശമാണ്.
ടോക്കിയോയിലെ ഷിനഗാവ-കുവിലെ മണ്ണിൽ നിന്ന് MK493-CF1 സ്ട്രെയിൻ വേർതിരിച്ചെടുത്തു. MK493-CF1 സ്ട്രെയിൻ നന്നായി ശാഖിതമായ സ്ട്രോമൽ മൈസീലിയം രൂപപ്പെടുത്തി. 16S റൈബോസോമൽ RNA ജീനിന്റെ (1422 bp) ഭാഗിക ക്രമം നിർണ്ണയിക്കപ്പെട്ടു. ഈ സ്ട്രെയിൻ S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: സാധാരണ സ്ട്രെയിൻ, 99.93%) നോട് വളരെ സാമ്യമുള്ളതാണ്. ഈ ഫലത്തെ അടിസ്ഥാനമാക്കി, ഈ സ്ട്രെയിൻ S. werraensis എന്ന തരം സ്ട്രെയിനുമായി അടുത്ത ബന്ധമുള്ളതാണെന്ന് നിർണ്ണയിക്കപ്പെട്ടു. അതിനാൽ, ഈ സ്ട്രെയിനിന് ഞങ്ങൾ താൽക്കാലികമായി S. werraensis MK493-CF1 എന്ന് പേരിട്ടു. S. werraensis ISP 5486T യും ഇതേ ബയോആക്ടീവ് സംയുക്തങ്ങൾ ഉത്പാദിപ്പിക്കുന്നു. ഈ സൂക്ഷ്മാണുക്കളിൽ നിന്ന് പ്രകൃതിദത്ത ഉൽപ്പന്നങ്ങൾ ലഭിക്കുന്നതിനെക്കുറിച്ച് ആദ്യകാല ഗവേഷണങ്ങൾ കുറവായതിനാൽ, കൂടുതൽ രാസ ഗവേഷണം നടത്തി. 30°C താപനിലയിൽ 14 ദിവസത്തേക്ക് ബാർലി മീഡിയത്തിൽ S. werraensis MK493-CF1 കൃഷി ചെയ്ത ശേഷം, മീഡിയം 50% EtOH ഉപയോഗിച്ച് വേർതിരിച്ചെടുത്തു. 59.5 മില്ലിഗ്രാം അസംസ്കൃത സത്ത് ലഭിക്കാൻ 60 മില്ലി സാമ്പിൾ ഉണക്കി. N-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxamide (1, coumamonamide എന്ന് പേരിട്ടിരിക്കുന്നു, 36.0 mg) നൽകുന്നതിനായി അസംസ്കൃത സത്ത് റിവേഴ്സ് ഫേസ് HPLC-ക്ക് വിധേയമാക്കി. 1 ന്റെ ആകെ അളവ് അസംസ്കൃത സത്തിന്റെ ഏകദേശം 60% ആണ്. അതിനാൽ, കുമാമോട്ടോഅമൈഡ് 1 ന്റെ ഗുണങ്ങൾ വിശദമായി പഠിക്കാൻ ഞങ്ങൾ തീരുമാനിച്ചു.
കൊമാമോണമൈഡ് 1 ഒരു വെളുത്ത അമോർഫസ് പൊടിയാണ്, ഉയർന്ന റെസല്യൂഷൻ മാസ് സ്പെക്ട്രോമെട്രി (HRESIMS) C6H8N2O2 സ്ഥിരീകരിക്കുന്നു (ചിത്രം 1). ഈ സംയുക്തത്തിന്റെ C2-സബ്സ്റ്റിറ്റ്യൂട്ടഡ് പൈറോൾ ശകലം δH 6.94 (1H, t, J = 2.8, 4.8 Hz, H-4), δH 6.78 (1H, d, J = 2.5, 1H NMR സ്പെക്ട്രത്തിൽ δH: 4.5 Hz, H-5), δH 6.78 (1H, d, J = 2.5 Hz, H-6) എന്നിവയാൽ സവിശേഷതയാണ്, കൂടാതെ 13C NMR സ്പെക്ട്രം നാല് sp2 കാർബൺ ആറ്റങ്ങളുടെ സാന്നിധ്യം കാണിക്കുന്നു. C2 സ്ഥാനത്ത് ഒരു അമൈഡ് ഗ്രൂപ്പിന്റെ സാന്നിധ്യം δC 161.1-ൽ C-3 പ്രോട്ടോണിൽ നിന്ന് അമൈഡ് കാർബോണൈൽ കാർബണിലേക്കുള്ള HMBC പരസ്പരബന്ധം വഴി വിലയിരുത്തി. കൂടാതെ, δH 4.10 (3H, S), δC 68.3 എന്നിവയിൽ 1 H ഉം 13 C ഉം NMR കൊടുമുടികൾ തന്മാത്രയിൽ N-മെത്തോക്സി ഗ്രൂപ്പുകളുടെ സാന്നിധ്യത്തെ സൂചിപ്പിക്കുന്നു. എൻഹാൻസ്ഡ് ഡിഫറൻസ് സ്പെക്ട്രോസ്കോപ്പി, ന്യൂക്ലിയർ ഓവർഹൌസർ ചുരുക്കെഴുത്ത് (NOEDF) പോലുള്ള സ്പെക്ട്രോസ്കോപ്പിക് വിശകലനം ഉപയോഗിച്ച് മെത്തോക്സി ഗ്രൂപ്പിന്റെ ശരിയായ സ്ഥാനം ഇതുവരെ നിർണ്ണയിച്ചിട്ടില്ലെങ്കിലും, N-മെത്തോക്സി-1H-പൈറോൾ-2-കാർബോക്സാമൈഡ് ആദ്യത്തെ കാൻഡിഡേറ്റ് സംയുക്തമായി മാറി.
1 ന്റെ ശരിയായ ഘടന നിർണ്ണയിക്കാൻ, ഒരു മൊത്തം സിന്തസിസ് നടത്തി (ചിത്രം 2a). വാണിജ്യപരമായി ലഭ്യമായ 2-അമിനോപിരിഡിൻ 2 ന്റെ m-CPBA ഉപയോഗിച്ചുള്ള ചികിത്സ, ക്വാണ്ടിറ്റേറ്റീവ് യീൽഡിൽ അനുബന്ധ N-ഓക്സൈഡ് 3 ൽ കലാശിച്ചു. 2 ന്റെ 2-അമിനോഅസിഡേഷനുശേഷം, അബ്രമോവിച്ച് വിവരിച്ച സൈക്ലോകണ്ടൻസേഷൻ പ്രതിപ്രവർത്തനം 90°C ൽ ബെൻസീനിൽ നടത്തി, ആവശ്യമുള്ള 1-ഹൈഡ്രോക്സി-1H-പൈറോൾ-2-കാർബോണിട്രൈൽ 5 ഗ്രാം ആയി ലഭിച്ചു. വേഗത 60% (രണ്ട് ഘട്ടങ്ങൾ). 15,16. 4 ന്റെ മെത്തിലൈസേഷനും ജലവിശ്ലേഷണവും പിന്നീട് നല്ല വിളവിൽ 1-മെത്തോക്സി-1H-പൈറോൾ-2-കാർബോക്സിലിക് ആസിഡ് ("കുമോട്ടോണിക് ആസിഡ്" എന്ന് വിളിക്കുന്നു, 6) നൽകി (70%, രണ്ട് ഘട്ടങ്ങൾ). ഒടുവിൽ, ജലീയ അമോണിയ ഉപയോഗിച്ച് ആസിഡ് ക്ലോറൈഡ് ഇന്റർമീഡിയറ്റ് 6 വഴിയുള്ള അമിഡേഷൻ 98% വിളവിൽ കുമാമോട്ടോ അമിഡിന് 1 നൽകി. സിന്തസൈസ് ചെയ്ത 1 ന്റെ എല്ലാ സ്പെക്ട്രൽ ഡാറ്റയും ഒറ്റപ്പെട്ട 1 ന് സമാനമായിരുന്നു, അതിനാൽ 1 ന്റെ ഘടന നിർണ്ണയിക്കപ്പെട്ടു;
ഉർബെനാമൈഡിന്റെയും ഉർബെനിക് ആസിഡിന്റെയും ജൈവിക പ്രവർത്തനത്തിന്റെ പൊതുവായ സമന്വയവും വിശകലനവും. (എ) കുമാമോട്ടോ അമൈഡിന്റെ ആകെ സമന്വയം. (ബി) ഏഴ് ദിവസം പ്രായമുള്ള കാട്ടു-തരം അറബിഡോപ്സിസ് കൊളംബിയ (കോൾ) തൈകൾ സൂചിപ്പിച്ച സാന്ദ്രതയിൽ കൊമാമോണാമൈഡ് 6 അല്ലെങ്കിൽ കൊമാമോണാമൈഡ് 1 അടങ്ങിയ മുറാഷിഗെ, സ്കൂഗ് (എംഎസ്) പ്ലേറ്റുകളിൽ വളർത്തി. സ്കെയിൽ ബാർ = 1 സെ.മീ.
ആദ്യം, സസ്യവളർച്ചയെ മോഡുലേറ്റ് ചെയ്യാനുള്ള കഴിവ് കണക്കിലെടുത്ത് ഉർബെനാമൈഡിന്റെയും അതിന്റെ ഇടനിലക്കാരുടെയും ജൈവിക പ്രവർത്തനങ്ങൾ ഞങ്ങൾ വിലയിരുത്തി. എംഎസ് അഗർ മീഡിയത്തിലും സംസ്കരിച്ച അറബിഡോപ്സിസ് താലിയാന തൈകളിലും വിവിധ സാന്ദ്രതയിലുള്ള ഉർസ്മോണാമൈഡ് 1 അല്ലെങ്കിൽ ഉർസ്മോണിക് ആസിഡ് 6 ഞങ്ങൾ ചേർത്തു. 6 ന്റെ ഉയർന്ന സാന്ദ്രത (500 μM) വേരുകളുടെ വളർച്ചയെ തടസ്സപ്പെടുത്തുന്നുവെന്ന് ഈ പരിശോധനകൾ കാണിച്ചു (ചിത്രം 2b). അടുത്തതായി, 6 ന്റെ N1 സ്ഥാനം മാറ്റിസ്ഥാപിച്ചുകൊണ്ട് ഞങ്ങൾ വിവിധ ഡെറിവേറ്റീവുകൾ സൃഷ്ടിക്കുകയും അവയിൽ ഘടന-പ്രവർത്തന ബന്ധ പഠനങ്ങൾ നടത്തുകയും ചെയ്തു (അനലോഗ് സിന്തസിസ് പ്രക്രിയയെ പിന്തുണയ്ക്കുന്ന വിവരങ്ങളിൽ (SI) വിവരിച്ചിരിക്കുന്നു). 50 μM ഉർസോണിക് ആസിഡ് ഡെറിവേറ്റീവുകൾ അടങ്ങിയ ഒരു മാധ്യമത്തിലാണ് അറബിഡോപ്സിസ് തൈകൾ വളർത്തിയത്, വേരിന്റെ നീളം അളന്നു. ചിത്രത്തിൽ കാണിച്ചിരിക്കുന്നതുപോലെ. ചിത്രം 3a, b, S1 എന്നിവയിൽ കാണിച്ചിരിക്കുന്നതുപോലെ, കൂമാമോ ആസിഡുകൾക്ക് N1 സ്ഥാനത്ത് വ്യത്യസ്ത നീളത്തിലുള്ള രേഖീയ ആൽകോക്സി ശൃംഖലകളോ (9, 10, 11, 12, 13) വലിയ ആൽകോക്സി ശൃംഖലകളോ (15, 16, 17) ഉണ്ട്. ഡെറിവേറ്റീവുകൾ വേരുകളുടെ വളർച്ചയെ ഗണ്യമായി തടഞ്ഞു. കൂടാതെ, 200 μM 10, 11, അല്ലെങ്കിൽ 17 എന്നിവയുടെ പ്രയോഗം മുളയ്ക്കുന്നതിനെ തടയുന്നതായി ഞങ്ങൾ കണ്ടെത്തി (ചിത്രം 3c, S2).
കുമാമോട്ടോ അമൈഡിന്റെയും അനുബന്ധ സംയുക്തങ്ങളുടെയും ഘടന-പ്രവർത്തന ബന്ധത്തെക്കുറിച്ചുള്ള പഠനം. (എ) അനലോഗുകളുടെ ഘടനയും സിന്തസിസ് സ്കീമും. (ബി) 50 μM കൊമാമോണമൈഡ് ഡെറിവേറ്റീവുകൾ ഉപയോഗിച്ചോ അല്ലാതെയോ MS മീഡിയത്തിൽ വളർത്തിയ 7 ദിവസം പ്രായമുള്ള തൈകളുടെ വേരിന്റെ നീളത്തിന്റെ അളവ്. വ്യാജ ചികിത്സയുമായി നക്ഷത്രചിഹ്നങ്ങൾ കാര്യമായ വ്യത്യാസങ്ങൾ സൂചിപ്പിക്കുന്നു (t ടെസ്റ്റ്, p< 0.05). n>18. ഡാറ്റ ശരാശരി ± SD ആയി കാണിച്ചിരിക്കുന്നു. nt എന്നാൽ "പരീക്ഷിച്ചിട്ടില്ല" എന്നാണ് അർത്ഥമാക്കുന്നത്, കാരണം 50% ൽ കൂടുതൽ വിത്തുകൾ മുളച്ചില്ല. (സി) 200 μM കൊമമോണമൈഡും അനുബന്ധ സംയുക്തങ്ങളും ഉപയോഗിച്ചോ അല്ലാതെയോ MS മീഡിയത്തിൽ 7 ദിവസത്തേക്ക് ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്ത സംസ്കരിച്ച വിത്തുകളുടെ മുളയ്ക്കൽ നിരക്കിന്റെ അളവ്. വ്യാജ ചികിത്സയുമായി (ചി-സ്ക്വയർ ടെസ്റ്റ്) കാര്യമായ വ്യത്യാസങ്ങൾ നക്ഷത്രചിഹ്നങ്ങൾ സൂചിപ്പിക്കുന്നു. n=96.
രസകരമെന്നു പറയട്ടെ, C9 നേക്കാൾ നീളമുള്ള ആൽക്കൈൽ സൈഡ് ചെയിനുകൾ ചേർത്തത് ഇൻഹിബിറ്ററി പ്രവർത്തനം കുറച്ചു, കുമാമോട്ടോയിക് ആസിഡുമായി ബന്ധപ്പെട്ട സംയുക്തങ്ങൾക്ക് അവയുടെ ജൈവിക പ്രവർത്തനം പ്രകടിപ്പിക്കുന്നതിന് ഒരു നിശ്ചിത വലുപ്പത്തിലുള്ള സൈഡ് ചെയിനുകൾ ആവശ്യമാണെന്ന് ഇത് സൂചിപ്പിക്കുന്നു.
ഘടന-പ്രവർത്തന ബന്ധ വിശകലനം C9 ഉർസോണിക് ആസിഡായി പരിഷ്കരിച്ചതായും ഉർസോണിക് ആസിഡിന്റെ നോൺ-നൈലോക്സി ഡെറിവേറ്റീവ് (ഇനി മുതൽ KAND 11 എന്ന് വിളിക്കുന്നു) ഏറ്റവും ഫലപ്രദമായ സസ്യവളർച്ചാ ഇൻഹിബിറ്ററാണെന്നും കാണിച്ചതിനാൽ, ഞങ്ങൾ KAND 11 ന്റെ കൂടുതൽ വിശദമായ സ്വഭാവം നടത്തി. 50 μM KAND 11 ഉപയോഗിച്ചുള്ള അറബിഡോപ്സിസ് ചികിത്സ മുളയ്ക്കുന്നതിനെ പൂർണ്ണമായും തടഞ്ഞു, അതേസമയം KAND 11 ന്റെ കുറഞ്ഞ സാന്ദ്രത (40, 30, 20, അല്ലെങ്കിൽ 10 μM) ഡോസ്-ആശ്രിത രീതിയിൽ വേരുകളുടെ വളർച്ചയെ തടഞ്ഞു (ചിത്രം 4a, b). KAND 11 റൂട്ട് മെറിസ്റ്റമിന്റെ പ്രവർത്തനക്ഷമതയെ ബാധിക്കുന്നുണ്ടോ എന്ന് പരിശോധിക്കാൻ, പ്രൊപ്പിഡിയം അയഡിഡ് (PI) കലർന്ന റൂട്ട് മെറിസ്റ്റമുകൾ ഞങ്ങൾ പരിശോധിക്കുകയും മെറിസ്റ്റം ഏരിയ വലുപ്പം അളക്കുകയും ചെയ്തു. 25 μM KAND-11 അടങ്ങിയ ഒരു മാധ്യമത്തിൽ വളർത്തിയ തൈകളുടെ മെറിസ്റ്റത്തിന്റെ വലിപ്പം 151.1 ± 32.5 μm ആയിരുന്നു, അതേസമയം DMSO അടങ്ങിയ ഒരു നിയന്ത്രണ മാധ്യമത്തിൽ വളർത്തിയ തൈകളുടെ മെറിസ്റ്റത്തിന്റെ വലിപ്പം 264.7 ± 30.8 μm ആയിരുന്നു (ചിത്രം 4c, d), ഇത് KAND-11 കോശ പ്രവർത്തനം പുനഃസ്ഥാപിക്കുന്നുവെന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു. വ്യാപിക്കുന്നു. റൂട്ട് മെറിസ്റ്റം. ഇതിന് അനുസൃതമായി, KAND 11 ചികിത്സ റൂട്ട് മെറിസ്റ്റമിലെ കോശ വിഭജന മാർക്കർ CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS സിഗ്നലിന്റെ അളവ് കുറച്ചു (ചിത്രം 4e) 17. ഈ ഫലങ്ങൾ സൂചിപ്പിക്കുന്നത് KAND 11 കോശ വ്യാപന പ്രവർത്തനം കുറയ്ക്കുന്നതിലൂടെ വേരുകളുടെ വളർച്ചയെ തടയുന്നു എന്നാണ്.
വളർച്ചയിൽ ഉർബെനോണിക് ആസിഡ് ഡെറിവേറ്റീവുകളുടെ (ഉർബെനിലോക്സി ഡെറിവേറ്റീവുകൾ) തടസ്സപ്പെടുത്തുന്ന ഫലത്തിന്റെ വിശകലനം. (എ) KAND 11 ന്റെ സൂചിപ്പിച്ച സാന്ദ്രതയിൽ MS പ്ലേറ്റുകളിൽ വളർത്തിയ 7 ദിവസം പ്രായമുള്ള കാട്ടു-തരം കോൾ തൈകൾ. സ്കെയിൽ ബാർ = 1 സെ.മീ. (ബി) വേരിന്റെ നീളത്തിന്റെ അളവ്. അക്ഷരങ്ങൾ കാര്യമായ വ്യത്യാസങ്ങൾ സൂചിപ്പിക്കുന്നു (ടുകി എച്ച്എസ്ഡി ടെസ്റ്റ്, പി.< 0.05). n>16. ഡാറ്റ ശരാശരി ± SD ആയി കാണിച്ചിരിക്കുന്നു. (സി) 25 μM KAND ഉള്ളതോ അല്ലാതെയോ MS പ്ലേറ്റുകളിൽ വളർത്തിയ പ്രൊപ്പിഡിയം അയഡൈഡ്-സ്റ്റെയിൻഡ് വൈൽഡ്-ടൈപ്പ് കോൾ വേരുകളുടെ കോൺഫോക്കൽ മൈക്രോസ്കോപ്പി 11. വെളുത്ത ബ്രാക്കറ്റുകൾ റൂട്ട് മെറിസ്റ്റത്തെ സൂചിപ്പിക്കുന്നു. സ്കെയിൽ ബാർ = 100 µm. (ഡി) റൂട്ട് മെറിസ്റ്റം വലുപ്പത്തിന്റെ അളവ് (n = 10 മുതൽ 11 വരെ). ടി-ടെസ്റ്റ് ഉപയോഗിച്ച് സ്ഥിതിവിവരക്കണക്ക് വ്യത്യാസങ്ങൾ നിർണ്ണയിച്ചു (p< 0.05). ബാറുകൾ ശരാശരി മെറിസ്റ്റം വലുപ്പത്തെ പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നു. (ഇ) CDKB2 കൺസ്ട്രക്റ്റ് അടങ്ങിയ ഒരു റൂട്ട് മെറിസ്റ്റത്തിന്റെ ഡിഫറൻഷ്യൽ ഇന്റർഫറൻസ് കോൺട്രാസ്റ്റ് (DIC) മൈക്രോസ്കോപ്പി; 1pro: CDKB2; 25 µM KAND അസ്സേ ഉള്ളതോ അല്ലാതെയോ MS പ്ലേറ്റുകളിൽ വളർത്തിയ 5 ദിവസം പ്രായമുള്ള തൈകളിൽ 1-GUS സ്റ്റെയിൻ ചെയ്തതും സ്റ്റെയിൻ ചെയ്തതും.
മറ്റൊരു ദ്വിബീജ സസ്യമായ പുകയില (നിക്കോട്ടിയാന ടാബകം), ഒരു പ്രധാന കര സസ്യ മാതൃകാ ജീവിയായ ലിവർവോർട്ട് (മാർച്ചാന്റിയ പോളിമോർഫ) എന്നിവ ഉപയോഗിച്ച് KAND 11 ന്റെ ഫൈറ്റോടോക്സിസിറ്റി കൂടുതൽ പരീക്ഷിച്ചു. അറബിഡോപ്സിസിന്റെ കാര്യത്തിലെന്നപോലെ, 25 μM KAND 11 അടങ്ങിയ മീഡിയത്തിൽ വളർത്തിയ പുകയില SR-1 തൈകൾ ചെറിയ വേരുകൾ ഉത്പാദിപ്പിച്ചു (ചിത്രം 5a). കൂടാതെ, 48 വിത്തുകളിൽ 40 എണ്ണവും 200 μM KAND 11 അടങ്ങിയ പ്ലേറ്റുകളിൽ മുളച്ചു, അതേസമയം 48 വിത്തുകളും മോക്ക്-ട്രീറ്റ് ചെയ്ത മീഡിയയിൽ മുളച്ചു, ഇത് KAND യുടെ ഉയർന്ന സാന്ദ്രത പ്രധാനമാണെന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു (p< 0.05; chi test -square) പുകയിലയുടെ മുളയ്ക്കലിനെ തടഞ്ഞു. (ചിത്രം 5b). കൂടാതെ, ലിവർവോർട്ടിൽ ബാക്ടീരിയ വളർച്ചയെ തടഞ്ഞ KAND 11 ന്റെ സാന്ദ്രത അറബിഡോപ്സിസിലെ ഫലപ്രദമായ സാന്ദ്രതയ്ക്ക് സമാനമാണ് (ചിത്രം 5c). ഈ ഫലങ്ങൾ സൂചിപ്പിക്കുന്നത് KAND 11 ന് വിവിധ സസ്യങ്ങളുടെ വളർച്ചയെ തടയാൻ കഴിയുമെന്നാണ്. തുടർന്ന് മറ്റ് ജീവികളിൽ, അതായത് മനുഷ്യ HeLa കോശങ്ങളിലും Escherichia coli strain DH5α ലും, ഉയർന്ന മൃഗങ്ങളുടെയും ബാക്ടീരിയകളുടെയും പ്രതിനിധികളായി കരടി മോണോഅമൈഡുമായി ബന്ധപ്പെട്ട സംയുക്തങ്ങളുടെ സൈറ്റോടോക്സിസിറ്റി ഞങ്ങൾ അന്വേഷിച്ചു. കോശ വ്യാപന പരിശോധനകളുടെ ഒരു പരമ്പരയിൽ, 100 μM സാന്ദ്രതയിൽ (ചിത്രം 5d,e) കൊമമോണമൈഡ് 1, കൊമമോണമൈഡിക് ആസിഡ് 6, KAND 11 എന്നിവ HeLa അല്ലെങ്കിൽ E. coli കോശങ്ങളുടെ വളർച്ചയെ ബാധിച്ചിട്ടില്ലെന്ന് ഞങ്ങൾ നിരീക്ഷിച്ചു.
അറബിഡോപ്സിസ് ജീവികളിൽ KAND 11 ന്റെ വളർച്ച തടയൽ. (എ) രണ്ടാഴ്ച പ്രായമുള്ള കാട്ടു-തരം SR-1 പുകയില തൈകൾ 25 μM KAND 11 അടങ്ങിയ ലംബമായി സ്ഥാപിച്ചിരിക്കുന്ന MS പ്ലേറ്റുകളിലാണ് വളർത്തിയത്. (ബി) രണ്ടാഴ്ച പ്രായമുള്ള കാട്ടു-തരം SR-1 പുകയില തൈകൾ 200 μM KAND 11 അടങ്ങിയ തിരശ്ചീനമായി സ്ഥാപിച്ചിരിക്കുന്ന MS പ്ലേറ്റുകളിലാണ് വളർത്തിയത്. (സി) KAND 11 ന്റെ സൂചിപ്പിച്ച സാന്ദ്രതകളുള്ള ഗാംബോർഗ് B5 പ്ലേറ്റുകളിൽ വളർത്തിയ രണ്ടാഴ്ച പ്രായമുള്ള കാട്ടു-തരം Tak-1 ലിവർവോർട്ട് മുകുളങ്ങൾ. രണ്ടാഴ്ചത്തെ ഇൻകുബേഷൻ കാലയളവിൽ വളർച്ച നിലച്ച ബീജങ്ങളെ ചുവന്ന അമ്പടയാളങ്ങൾ സൂചിപ്പിക്കുന്നു. (ഡി) HeLa കോശങ്ങളുടെ കോശ വ്യാപന പരിശോധന. ഒരു സെൽ കൗണ്ടിംഗ് കിറ്റ് 8 (ഡോജിൻഡോ) ഉപയോഗിച്ച് നിശ്ചിത സമയ ഇടവേളകളിൽ പ്രായോഗിക കോശങ്ങളുടെ എണ്ണം അളന്നു. ഒരു നിയന്ത്രണമെന്ന നിലയിൽ, 5 μg/ml ആക്റ്റിനോമൈസിൻ D (ആക്റ്റ് D) ഉപയോഗിച്ച് HeLa കോശങ്ങളെ ചികിത്സിച്ചു, ഇത് RNA പോളിമറേസ് ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷനെ തടയുകയും കോശ മരണത്തിന് കാരണമാവുകയും ചെയ്യുന്നു. വിശകലനങ്ങൾ ട്രിപ്പിളിക്കേറ്റിൽ നടത്തി. (ഇ) E. coli സെൽ വ്യാപന പരിശോധന. OD600 അളക്കുന്നതിലൂടെ E. coli വളർച്ച വിശകലനം ചെയ്തു. ഒരു നിയന്ത്രണമെന്ന നിലയിൽ, ബാക്ടീരിയൽ സെൽ വാൾ സിന്തസിസിനെ തടയുന്ന 50 μg/ml ആമ്പിസിലിൻ (Amp) ഉപയോഗിച്ച് കോശങ്ങളെ ചികിത്സിച്ചു. വിശകലനങ്ങൾ മൂന്ന് തവണ നടത്തി.
യുറാമൈഡുമായി ബന്ധപ്പെട്ട സംയുക്തങ്ങൾ മൂലമുണ്ടാകുന്ന സൈറ്റോടോക്സിസിറ്റിയുടെ പ്രവർത്തനരീതി മനസ്സിലാക്കാൻ, മിതമായ ഇൻഹിബിറ്ററി ഇഫക്റ്റുകളുള്ള ഉർബെനിക് ആസിഡ് ഡെറിവേറ്റീവുകൾ ഞങ്ങൾ വീണ്ടും വിശകലനം ചെയ്തു. ചിത്രത്തിൽ കാണിച്ചിരിക്കുന്നതുപോലെ. ചിത്രം 2b, 6a-യിൽ കാണിച്ചിരിക്കുന്നതുപോലെ, ഉയർന്ന സാന്ദ്രതയിൽ (200 μM) ഉർമോട്ടോണിക് ആസിഡ് 6 അടങ്ങിയ അഗർ പ്ലേറ്റുകളിൽ വളർത്തിയ തൈകൾ ചെറുതും ഇടത്തേക്ക് വളഞ്ഞതുമായ വേരുകൾ ഉൽ‌പാദിപ്പിച്ചു (θ = – 23.7 ± 6.1), അതേസമയം നിയന്ത്രണ മാധ്യമത്തിൽ വളർത്തിയ തൈകളിൽ, തൈകൾ ഏതാണ്ട് നേരായ വേരുകൾ ഉൽ‌പാദിപ്പിച്ചു (θ = – 3.8 ± 7.1). കോർട്ടിക്കൽ മൈക്രോട്യൂബ്യൂളുകളുടെ പ്രവർത്തനരഹിതതയിൽ നിന്നാണ് ഈ സ്വഭാവ സവിശേഷതയായ ചരിഞ്ഞ വളർച്ച ഉണ്ടാകുന്നതെന്ന് അറിയപ്പെടുന്നു. ഈ കണ്ടെത്തലിന് അനുസൃതമായി, മൈക്രോട്യൂബ്യൂൾ-അസ്ഥിരമാക്കുന്ന മരുന്നുകളായ ഡിസോപിറാമൈഡും ഒറിസാലിനും ഞങ്ങളുടെ വളർച്ചാ സാഹചര്യങ്ങളിൽ സമാനമായ റൂട്ട് ടിൽറ്റിംഗിന് കാരണമായി (ചിത്രം 2b, 6a). അതേ സമയം, ഞങ്ങൾ ഉർമോട്ടോണിക് ആസിഡ് ഡെറിവേറ്റീവുകൾ പരീക്ഷിക്കുകയും ചില സാന്ദ്രതകളിൽ ചരിഞ്ഞ റൂട്ട് വളർച്ചയ്ക്ക് കാരണമായ നിരവധി തിരഞ്ഞെടുക്കുകയും ചെയ്തു. 8, 9, 15 എന്നീ സംയുക്തങ്ങൾ യഥാക്രമം 75 μM, 50 μM, 40 μM എന്നീ വേരുകളുടെ വളർച്ചയുടെ ദിശ മാറ്റി, ഈ സംയുക്തങ്ങൾ മൈക്രോട്യൂബ്യൂളുകളെ ഫലപ്രദമായി അസ്ഥിരപ്പെടുത്തുമെന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു (ചിത്രം 2b, 6a). ഏറ്റവും ശക്തമായ ഉർസോളിക് ആസിഡ് ഡെറിവേറ്റീവായ KAND 11, കുറഞ്ഞ സാന്ദ്രതയിൽ (15 µM) ഞങ്ങൾ പരീക്ഷിച്ചു, KAND 11 ന്റെ പ്രയോഗം വേരുകളുടെ വളർച്ചയെ തടയുന്നുവെന്നും വേരുകളുടെ വളർച്ചയുടെ ദിശ അസമമാണെന്നും കണ്ടെത്തി, എന്നിരുന്നാലും അവ ഇടതുവശത്തേക്ക് ചരിഞ്ഞു (ചിത്രം C3). മൈക്രോട്യൂബ്യൂൾ-അസ്ഥിരമാക്കുന്ന മരുന്നുകളുടെ ഉയർന്ന സാന്ദ്രത ചിലപ്പോൾ വേരുകളുടെ ചരിവിന് കാരണമാകുന്നതിനുപകരം സസ്യവളർച്ചയെ തടയുന്നതിനാൽ, പിന്നീട് റൂട്ട് എപ്പിഡെർമൽ കോശങ്ങളിലെ കോർട്ടിക്കൽ മൈക്രോട്യൂബ്യൂളുകളെ നിരീക്ഷിച്ചുകൊണ്ട് KAND 11 മൈക്രോട്യൂബ്യൂളുകളെ ബാധിക്കാനുള്ള സാധ്യത ഞങ്ങൾ വിലയിരുത്തി. 25 μM KAND 11 ഉപയോഗിച്ച് ചികിത്സിച്ച തൈ വേരുകളുടെ എപ്പിഡെർമൽ കോശങ്ങളിൽ ആന്റി-β-ട്യൂബുലിൻ ആന്റിബോഡികൾ ഉപയോഗിച്ചുള്ള ഇമ്മ്യൂണോഹിസ്റ്റോകെമിസ്ട്രി, നീളമേറിയ മേഖലയിലെ എപ്പിഡെർമൽ കോശങ്ങളിലെ മിക്കവാറും എല്ലാ കോർട്ടിക്കൽ മൈക്രോട്യൂബ്യൂളുകളുടെയും തിരോധാനം കാണിച്ചു (ചിത്രം 6b). കുമാമോട്ടോണിക് ആസിഡും അതിന്റെ ഡെറിവേറ്റീവുകളും മൈക്രോട്യൂബ്യൂളുകളിൽ നേരിട്ടോ അല്ലാതെയോ പ്രവർത്തിച്ച് അവയെ തടസ്സപ്പെടുത്തുന്നുവെന്നും ഈ സംയുക്തങ്ങൾ പുതിയ മൈക്രോട്യൂബ്യൂൾ ഇൻഹിബിറ്ററുകളാണെന്നും ഈ ഫലങ്ങൾ സൂചിപ്പിക്കുന്നു.
അറബിഡോപ്സിസ് താലിയാനയിലെ ഉർസോണിക് ആസിഡും അതിന്റെ ഡെറിവേറ്റീവുകളും കോർട്ടിക്കൽ മൈക്രോട്യൂബ്യൂളുകളെ മാറ്റുന്നു. (എ) സൂചിപ്പിച്ച സാന്ദ്രതകളിൽ വിവിധ ഉർമോട്ടോണിക് ആസിഡ് ഡെറിവേറ്റീവുകളുടെ സാന്നിധ്യത്തിൽ വേരുകളുടെ ചെരിവ് കോൺ അളക്കുന്നു. മൈക്രോട്യൂബ്യൂളുകളെ തടയുന്നതായി അറിയപ്പെടുന്ന രണ്ട് സംയുക്തങ്ങളായ ഡിസോപിറാമൈഡ്, ഒറിസാലിൻ എന്നിവയുടെ ഫലങ്ങളും വിശകലനം ചെയ്തു. വേരുകളുടെ വളർച്ചാ കോൺ അളക്കാൻ ഉപയോഗിക്കുന്ന മാനദണ്ഡം ഇൻസെറ്റ് കാണിക്കുന്നു. വ്യാജ ചികിത്സയുമായി നക്ഷത്രചിഹ്നങ്ങൾ കാര്യമായ വ്യത്യാസങ്ങൾ സൂചിപ്പിക്കുന്നു (t ടെസ്റ്റ്, p< 0.05). n>19. സ്കെയിൽ ബാർ = 1 സെ.മീ. (ബി) എലങ്ങേഷൻ സോണിലെ എപ്പിഡെർമൽ സെല്ലുകളിലെ കോർട്ടിക്കൽ മൈക്രോട്യൂബ്യൂളുകൾ. 25 μM KAND 11 ഉള്ളതോ അല്ലാതെയോ MS പ്ലേറ്റുകളിൽ വളർത്തിയ വൈൽഡ്-ടൈപ്പ് അറബിഡോപ്സിസിലെ കോൾ വേരുകളിലെ മൈക്രോട്യൂബ്യൂളുകൾ β-ട്യൂബുലിൻ പ്രൈമറി ആന്റിബോഡികളും അലക്സാ ഫ്ലൂറിസം-കൺജുഗേറ്റഡ് സെക്കൻഡറി ആന്റിബോഡികളും ഉപയോഗിച്ച് ഇമ്മ്യൂണോഹിസ്റ്റോകെമിക്കൽ സ്റ്റെയിനിംഗ് വഴി ദൃശ്യവൽക്കരിച്ചു. സ്കെയിൽ ബാർ = 10 µm. (സി) റൂട്ട് മെറിസ്റ്റമിലെ മൈക്രോട്യൂബ്യൂളുകളുടെ മൈറ്റോട്ടിക് ഘടന. ഇമ്മ്യൂണോഹിസ്റ്റോകെമിക്കൽ സ്റ്റെയിനിംഗ് ഉപയോഗിച്ചാണ് മൈക്രോട്യൂബ്യൂളുകൾ ദൃശ്യവൽക്കരിച്ചത്. കോൺഫോക്കൽ ഇമേജുകളിൽ നിന്ന് പ്രോഫേസ് സോണുകൾ, സ്പിൻഡിലുകൾ, ഫ്രാഗ്മോപ്ലാസ്റ്റുകൾ എന്നിവയുൾപ്പെടെയുള്ള മൈറ്റോട്ടിക് ഘടനകൾ കണക്കാക്കി. അമ്പടയാളങ്ങൾ മൈറ്റോട്ടിക് മൈക്രോട്യൂബ്യൂൾ ഘടനകളെ സൂചിപ്പിക്കുന്നു. ഷാം ചികിത്സയുമായി നക്ഷത്രചിഹ്നങ്ങൾ കാര്യമായ വ്യത്യാസങ്ങൾ സൂചിപ്പിക്കുന്നു (t ടെസ്റ്റ്, പി< 0.05). n>9. സ്കെയിൽ ബാർ = 50 µm.
മൈക്രോട്യൂബ്യൂൾ പ്രവർത്തനത്തെ തടസ്സപ്പെടുത്താനുള്ള കഴിവ് ഉർസയ്ക്ക് ഉണ്ടെങ്കിലും, അതിന്റെ പ്രവർത്തനരീതി സാധാരണ മൈക്രോട്യൂബ്യൂൾ ഡിപോളിമറൈസിംഗ് ഏജന്റുകളിൽ നിന്ന് വ്യത്യസ്തമായിരിക്കുമെന്ന് പ്രതീക്ഷിക്കുന്നു. ഉദാഹരണത്തിന്, ഡിസോപിറാമൈഡ്, ഒറിസാലിൻ തുടങ്ങിയ മൈക്രോട്യൂബ്യൂൾ ഡിപോളിമറൈസിംഗ് ഏജന്റുകളുടെ ഉയർന്ന സാന്ദ്രത എപ്പിഡെർമൽ കോശങ്ങളുടെ അനിസോട്രോപിക് വികാസത്തിന് കാരണമാകുന്നു, അതേസമയം KAND 11 അങ്ങനെ ചെയ്യുന്നില്ല. കൂടാതെ, KAND 11 ഉം ഡിസോപിറാമൈഡും ഒരുമിച്ച് പ്രയോഗിക്കുന്നത് ഒരു സംയോജിത ഡിസോപിറാമൈഡ്-ഇൻഡ്യൂസ്ഡ് റൂട്ട് ഗ്രോത്ത് റെസ്പോൺസിന് കാരണമായി, KAND 11-ഇൻഡ്യൂസ്ഡ് ഗ്രോത്ത് ഇൻഹിബിഷൻ നിരീക്ഷിക്കപ്പെട്ടു (ചിത്രം S4). KAND 11 നോടുള്ള ഹൈപ്പർസെൻസിറ്റീവ് ഡിസോപിറാമൈഡ് 1-1 (phs1-1) മ്യൂട്ടന്റിന്റെ പ്രതികരണവും ഞങ്ങൾ വിശകലനം ചെയ്തു. phs1-1 ന് കാനോനിക്കൽ അല്ലാത്ത ട്യൂബുലിൻ കൈനേസ് പോയിന്റ് മ്യൂട്ടേഷൻ ഉണ്ട്, കൂടാതെ ഡിസോപിറാമൈഡ് ഉപയോഗിച്ച് ചികിത്സിക്കുമ്പോൾ ചെറിയ വേരുകൾ ഉത്പാദിപ്പിക്കുന്നു9,20. KAND 11 അടങ്ങിയ അഗർ മീഡിയത്തിൽ വളർത്തിയ phs1-1 മ്യൂട്ടന്റ് തൈകൾക്ക് ഡിസോപിറാമൈഡിൽ വളർത്തിയതിന് സമാനമായ ചെറിയ വേരുകൾ ഉണ്ടായിരുന്നു (ചിത്രം S5).
കൂടാതെ, KAND 11 ഉപയോഗിച്ച് ചികിത്സിച്ച തൈകളുടെ റൂട്ട് മെറിസ്റ്റമിൽ, പ്രോഫേസ് സോണുകൾ, സ്പിൻഡിലുകൾ, ഫ്രാഗ്മോപ്ലാസ്റ്റുകൾ തുടങ്ങിയ മൈറ്റോട്ടിക് മൈക്രോട്യൂബ്യൂൾ ഘടനകൾ ഞങ്ങൾ നിരീക്ഷിച്ചു. CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS-നുള്ള നിരീക്ഷണങ്ങൾക്ക് അനുസൃതമായി, മൈറ്റോട്ടിക് മൈക്രോട്യൂബ്യൂളുകളുടെ എണ്ണത്തിൽ ഗണ്യമായ കുറവ് നിരീക്ഷിക്കപ്പെട്ടു (ചിത്രം. .6c).
സബ്സെല്ലുലാർ റെസല്യൂഷനിൽ KAND 11 ന്റെ സൈറ്റോടോക്സിസിറ്റി ചിത്രീകരിക്കുന്നതിന്, ഞങ്ങൾ പുകയില BY-2 സസ്പെൻഷൻ സെല്ലുകളെ KAND 11 ഉപയോഗിച്ച് ചികിത്സിക്കുകയും അവയുടെ പ്രതികരണം നിരീക്ഷിക്കുകയും ചെയ്തു. കോർട്ടിക്കൽ മൈക്രോട്യൂബ്യൂളുകളിൽ KAND 11 ന്റെ പ്രഭാവം വിലയിരുത്തുന്നതിനായി, ഫ്ലൂറസെന്റ് ആയി മൈക്രോട്യൂബ്യൂളുകൾ പ്രകടിപ്പിക്കുന്ന BY-2 സെല്ലുകളിലേക്ക് ഞങ്ങൾ ആദ്യം KAND 11 ചേർത്തു. ഇമേജ് വിശകലനം ഉപയോഗിച്ച് കോർട്ടിക്കൽ മൈക്രോട്യൂബ്യൂൾ സാന്ദ്രത വിലയിരുത്തി, ഇത് സൈറ്റോപ്ലാസ്മിക് പിക്സലുകൾക്കിടയിലുള്ള സൈറ്റോസ്കെലെറ്റൽ പിക്സലുകളുടെ ശതമാനം കണക്കാക്കി. 50 μM അല്ലെങ്കിൽ 100 μM KAND 11 ഉപയോഗിച്ച് 1 മണിക്കൂർ ചികിത്സിച്ചതിന് ശേഷം, സാന്ദ്രത യഥാക്രമം 0.94 ± 0.74% അല്ലെങ്കിൽ 0.23 ± 0.28% ആയി ഗണ്യമായി കുറഞ്ഞുവെന്ന് പരിശോധനാ ഫലങ്ങൾ കാണിച്ചു, അതേസമയം DMSO ഉപയോഗിച്ച് ചികിത്സിച്ച കോശങ്ങളുടെ സാന്ദ്രത 1.61 ± 0.34% ആയിരുന്നു (ചിത്രം 7a). KAND 11 ചികിത്സ കോർട്ടിക്കൽ മൈക്രോട്യൂബ്യൂളുകളുടെ ഡീപോളിമറൈസേഷനെ പ്രേരിപ്പിക്കുന്നു എന്ന അറബിഡോപ്സിസിലെ നിരീക്ഷണവുമായി ഈ ഫലങ്ങൾ പൊരുത്തപ്പെടുന്നു (ചിത്രം 6b). KAND 11 ന്റെ അതേ സാന്ദ്രത ഉപയോഗിച്ചുള്ള ചികിത്സയ്ക്ക് ശേഷം GFP-ABD-ലേബൽ ചെയ്ത ആക്റ്റിൻ ഫിലമെന്റുകളുള്ള BY-2 ലൈനിലും ഞങ്ങൾ പരിശോധിച്ചു, KAND 11 ചികിത്സ ആക്റ്റിൻ ഫിലമെന്റുകളെ തടസ്സപ്പെടുത്തുന്നുവെന്ന് ഞങ്ങൾ നിരീക്ഷിച്ചു. 50 μM അല്ലെങ്കിൽ 100 μM KAND 11 ഉപയോഗിച്ചുള്ള ചികിത്സ ആക്റ്റിൻ ഫിലമെന്റുകളുടെ സാന്ദ്രതയെ യഥാക്രമം 1.20 ± 0.62% അല്ലെങ്കിൽ 0.61 ± 0.26% ആയി ഗണ്യമായി കുറച്ചു, അതേസമയം DMSO- ചികിത്സിച്ച കോശങ്ങളിലെ സാന്ദ്രത 1.69 ± 0.51% ആയിരുന്നു (ചിത്രം 2). 7b). ആക്റ്റിൻ ഫിലമെന്റുകളെ ബാധിക്കാത്ത പ്രൊപിസാമൈഡിന്റെയും മൈക്രോട്യൂബ്യൂളുകളെ ബാധിക്കാത്ത ആക്റ്റിൻ ഡീപോളിമറൈസറായ ലാട്രൻകുലിൻ ബിയുടെയും ഫലങ്ങളുമായി ഈ ഫലങ്ങൾ വ്യത്യാസപ്പെട്ടിരിക്കുന്നു (SI ചിത്രം S6). കൂടാതെ, കൊമമോണമൈഡ് 1, കൊമമോണമൈഡ് ആസിഡ് 6, അല്ലെങ്കിൽ KAND 11 എന്നിവ ഉപയോഗിച്ചുള്ള ചികിത്സ HeLa കോശങ്ങളിലെ മൈക്രോട്യൂബുലുകളെ ബാധിച്ചില്ല (SI ചിത്രം S7). അതിനാൽ, KAND 11 ന്റെ പ്രവർത്തനരീതി അറിയപ്പെടുന്ന സൈറ്റോസ്‌കെലിറ്റൺ ഡിസ്‌റപ്റ്ററുകളിൽ നിന്ന് വ്യത്യസ്തമാണെന്ന് വിശ്വസിക്കപ്പെടുന്നു. കൂടാതെ, KAND 11 ഉപയോഗിച്ച് ചികിത്സിച്ച BY-2 കോശങ്ങളെക്കുറിച്ചുള്ള ഞങ്ങളുടെ സൂക്ഷ്മ നിരീക്ഷണം KAND 11 ചികിത്സയ്ക്കിടെ കോശ മരണത്തിന്റെ ആരംഭം വെളിപ്പെടുത്തി, KAND 11 ചികിത്സയുടെ 30 മിനിറ്റിനുശേഷം ഇവാൻസ് നീലനിറമുള്ള മൃതകോശങ്ങളുടെ അനുപാതം ഗണ്യമായി വർദ്ധിച്ചില്ലെന്ന് കാണിച്ചു, അതേസമയം 50 μM അല്ലെങ്കിൽ 100 μM KAND ഉപയോഗിച്ചുള്ള 90 മിനിറ്റ് ചികിത്സയ്ക്ക് ശേഷം, മൃതകോശങ്ങളുടെ എണ്ണം യഥാക്രമം 43.7% അല്ലെങ്കിൽ 80.1% ആയി വർദ്ധിച്ചു (ചിത്രം 7c). ഒരുമിച്ച് എടുത്താൽ, ഈ ഡാറ്റ സൂചിപ്പിക്കുന്നത് നോവൽ ഉർസോളിക് ആസിഡ് ഡെറിവേറ്റീവ് KAND 11 എന്നത് മുമ്പ് അറിയപ്പെടാത്ത പ്രവർത്തനരീതിയുള്ള ഒരു സസ്യ-നിർദ്ദിഷ്ട സൈറ്റോസ്‌കെലിറ്റൽ ഇൻഹിബിറ്ററാണ് എന്നാണ്.
പുകയില BY-2 കോശങ്ങളുടെ കോർട്ടിക്കൽ മൈക്രോട്യൂബ്യൂളുകൾ, ആക്റ്റിൻ ഫിലമെന്റുകൾ, പ്രവർത്തനക്ഷമത എന്നിവയെ KAND ബാധിക്കുന്നു. (എ) TagRFP-TUA6 ന്റെ സാന്നിധ്യത്തിൽ BY-2 കോശങ്ങളിലെ കോർട്ടിക്കൽ മൈക്രോട്യൂബ്യൂളുകളുടെ ദൃശ്യവൽക്കരണം. KAND 11 (50 μM അല്ലെങ്കിൽ 100 μM) അല്ലെങ്കിൽ DMSO ഉപയോഗിച്ച് ചികിത്സിച്ച BY-2 കോശങ്ങളെ കോൺഫോക്കൽ മൈക്രോസ്കോപ്പി ഉപയോഗിച്ച് പരിശോധിച്ചു. 25 സ്വതന്ത്ര കോശങ്ങളുടെ മൈക്രോഗ്രാഫുകളിൽ നിന്നാണ് കോർട്ടിക്കൽ മൈക്രോട്യൂബ്യൂൾ സാന്ദ്രത കണക്കാക്കിയത്. അക്ഷരങ്ങൾ കാര്യമായ വ്യത്യാസങ്ങൾ സൂചിപ്പിക്കുന്നു (ടുകി HSD ടെസ്റ്റ്, പി.< 0.05). സ്കെയിൽ ബാർ = 10 µm. (b) GFP-ABD2 ന്റെ സാന്നിധ്യത്തിൽ ദൃശ്യവൽക്കരിച്ച BY-2 കോശങ്ങളിലെ കോർട്ടിക്കൽ ആക്റ്റിൻ ഫിലമെന്റുകൾ. KAND 11 (50 μM അല്ലെങ്കിൽ 100 μM) അല്ലെങ്കിൽ DMSO ഉപയോഗിച്ച് ചികിത്സിച്ച BY-2 കോശങ്ങളെ കോൺഫോക്കൽ മൈക്രോസ്കോപ്പി ഉപയോഗിച്ച് പരിശോധിച്ചു. 25 സ്വതന്ത്ര കോശങ്ങളുടെ മൈക്രോഗ്രാഫുകളിൽ നിന്നാണ് കോർട്ടിക്കൽ ആക്റ്റിൻ ഫിലമെന്റുകളുടെ സാന്ദ്രത കണക്കാക്കിയത്. അക്ഷരങ്ങൾ കാര്യമായ വ്യത്യാസങ്ങൾ സൂചിപ്പിക്കുന്നു (ടുകി HSD ടെസ്റ്റ്, p< 0.05). സ്കെയിൽ ബാർ = 10 µm. (സി) ഇവാൻസ് നീല സ്റ്റെയിനിംഗ് നടത്തിയ നിർജ്ജീവമായ BY-2 കോശങ്ങളുടെ നിരീക്ഷണം. KAND 11 (50 μM അല്ലെങ്കിൽ 100 μM) അല്ലെങ്കിൽ DMSO ഉപയോഗിച്ച് ചികിത്സിച്ച BY-2 കോശങ്ങളെ ബ്രൈറ്റ്-ഫീൽഡ് മൈക്രോസ്കോപ്പി ഉപയോഗിച്ച് പരിശോധിച്ചു. n=3. സ്കെയിൽ ബാർ = 100 µm.
പുതിയ പ്രകൃതിദത്ത ഉൽപ്പന്നങ്ങളുടെ കണ്ടെത്തലും പ്രയോഗവും വൈദ്യശാസ്ത്രം, കൃഷി എന്നിവയുൾപ്പെടെ മനുഷ്യജീവിതത്തിന്റെ വിവിധ വശങ്ങളിൽ ഗണ്യമായ പുരോഗതിക്ക് കാരണമായി. പ്രകൃതി വിഭവങ്ങളിൽ നിന്ന് ഉപയോഗപ്രദമായ സംയുക്തങ്ങൾ ലഭിക്കുന്നതിന് ചരിത്രപരമായ ഗവേഷണങ്ങൾ നടന്നിട്ടുണ്ട്. പ്രത്യേകിച്ചും, ആക്റ്റിനോമൈസെറ്റുകൾ നെമറ്റോഡുകൾക്കുള്ള ആന്റിപാരാസിറ്റിക് ആൻറിബയോട്ടിക്കുകളായി ഉപയോഗപ്രദമാണെന്ന് അറിയപ്പെടുന്നു, കാരണം അവയ്ക്ക് വിവിധ ദ്വിതീയ മെറ്റബോളിറ്റുകളായ അവെർമെക്റ്റിൻ, ഐവർമെക്റ്റിൻ, ബ്ലിയോമൈസിൻ എന്നിവയുടെ ലെഡ് സംയുക്തവും അതിന്റെ ഡെറിവേറ്റീവുകളും ഉത്പാദിപ്പിക്കാനുള്ള കഴിവുണ്ട്, ഇത് കാൻസർ വിരുദ്ധ ഏജന്റായി ഔഷധമായി ഉപയോഗിക്കുന്നു21,22. അതുപോലെ, ആക്റ്റിനോമൈസെറ്റുകളിൽ നിന്ന് വിവിധതരം കളനാശിനി സംയുക്തങ്ങൾ കണ്ടെത്തിയിട്ടുണ്ട്, അവയിൽ ചിലത് ഇതിനകം വാണിജ്യപരമായി ഉപയോഗിക്കുന്നു1,23. അതിനാൽ, ആവശ്യമുള്ള ജൈവിക പ്രവർത്തനങ്ങളുള്ള പ്രകൃതിദത്ത ഉൽപ്പന്നങ്ങളെ വേർതിരിച്ചെടുക്കുന്നതിനുള്ള ആക്റ്റിനോമൈസെറ്റ് മെറ്റബോളിറ്റുകളുടെ വിശകലനം ഫലപ്രദമായ ഒരു തന്ത്രമായി കണക്കാക്കപ്പെടുന്നു. ഈ പഠനത്തിൽ, എസ്. വെറൻസിസിൽ നിന്ന് കൊമമോണമൈഡ് എന്ന പുതിയ സംയുക്തം ഞങ്ങൾ കണ്ടെത്തി അത് വിജയകരമായി സമന്വയിപ്പിച്ചു. ഉർസോണിക് ആസിഡ് ഉർബെനാമൈഡിന്റെയും അതിന്റെ ഡെറിവേറ്റീവുകളുടെയും ഒരു സിന്തറ്റിക് ഇന്റർമീഡിയറ്റാണ്. ഇത് സ്വഭാവ സവിശേഷതയായ റൂട്ട് കേളിംഗിന് കാരണമാകും, മിതമായത് മുതൽ ശക്തമായ കളനാശിനി പ്രവർത്തനം പ്രകടിപ്പിക്കും, സസ്യ മൈക്രോട്യൂബുലുകളെ നേരിട്ടോ അല്ലാതെയോ നശിപ്പിക്കും. എന്നിരുന്നാലും, ഉർമോട്ടോണിക് ആസിഡിന്റെ പ്രവർത്തനരീതി നിലവിലുള്ള മൈക്രോട്യൂബ്യൂൾ ഇൻഹിബിറ്ററുകളിൽ നിന്ന് വ്യത്യസ്തമായിരിക്കാം, കാരണം KAND 11 ആക്റ്റിൻ ഫിലമെന്റുകളെ തടസ്സപ്പെടുത്തുകയും കോശ മരണത്തിന് കാരണമാവുകയും ചെയ്യുന്നു, ഇത് ഉർമോട്ടോണിക് ആസിഡും അതിന്റെ ഡെറിവേറ്റീവുകളും വിശാലമായ സൈറ്റോസ്‌കെലിറ്റൽ ഘടനകളെ സ്വാധീനിക്കുന്ന ഒരു നിയന്ത്രണ സംവിധാനത്തെ സൂചിപ്പിക്കുന്നു.
ഉർബെനോണിക് ആസിഡിന്റെ പ്രവർത്തനരീതി നന്നായി മനസ്സിലാക്കാൻ ഉർബെനോണിക് ആസിഡിന്റെ കൂടുതൽ വിശദമായ സ്വഭാവം സഹായിക്കും. പ്രത്യേകിച്ചും, ഉർസോണിക് ആസിഡും അതിന്റെ ഡെറിവേറ്റീവുകളും മൈക്രോട്യൂബ്യൂളുകളിൽ നേരിട്ട് പ്രവർത്തിക്കുകയും അവയെ ഡീപോളിമറൈസ് ചെയ്യുകയും ചെയ്യുന്നുണ്ടോ, അല്ലെങ്കിൽ അവയുടെ പ്രവർത്തനം മൈക്രോട്യൂബ്യൂൾ അസ്ഥിരീകരണത്തിൽ കലാശിക്കുന്നുണ്ടോ എന്ന് നിർണ്ണയിക്കാൻ, റിഡ്യൂസ്ഡ് മൈക്രോട്യൂബ്യൂളുകളുമായി ബന്ധിപ്പിക്കാനുള്ള ഉർസോണിക് ആസിഡിന്റെ കഴിവ് വിലയിരുത്തുക എന്നതാണ് അടുത്ത ലക്ഷ്യം. കൂടാതെ, മൈക്രോട്യൂബ്യൂളുകൾ നേരിട്ടുള്ള ലക്ഷ്യമല്ലാത്ത സാഹചര്യത്തിൽ, സസ്യകോശങ്ങളിലെ ഉർസോണിക് ആസിഡിന്റെ പ്രവർത്തന സ്ഥലവും തന്മാത്രാ ലക്ഷ്യങ്ങളും തിരിച്ചറിയുന്നത് അനുബന്ധ സംയുക്തങ്ങളുടെ ഗുണങ്ങളെയും കളനാശിനി പ്രവർത്തനം മെച്ചപ്പെടുത്താനുള്ള സാധ്യമായ വഴികളെയും കൂടുതൽ മനസ്സിലാക്കാൻ സഹായിക്കും. അറബിഡോപ്സിസ് താലിയാന, പുകയില, ലിവർവോർട്ട് തുടങ്ങിയ സസ്യങ്ങളുടെ വളർച്ചയിൽ ഉർസോണിക് ആസിഡിന്റെ അതുല്യമായ സൈറ്റോടോക്സിക് കഴിവ് ഞങ്ങളുടെ ബയോ ആക്ടിവിറ്റി പരിശോധന വെളിപ്പെടുത്തി, അതേസമയം ഇ. കോളിയോ ഹെല കോശങ്ങളോ ഒന്നും ബാധിച്ചിട്ടില്ല. തുറന്ന കാർഷിക മേഖലകളിൽ ഉപയോഗിക്കുന്നതിനായി കളനാശിനികളായി വികസിപ്പിച്ചെടുത്താൽ, മൃഗകോശങ്ങൾക്ക് വിഷാംശം കുറവോ വിഷാംശമോ ഇല്ലാത്തതോ ആണ് ഉർസോണിക് ആസിഡ് ഡെറിവേറ്റീവുകളുടെ ഒരു ഗുണം. തീർച്ചയായും, യൂക്കാരിയോട്ടുകളിൽ മൈക്രോട്യൂബ്യൂളുകൾ സാധാരണ ഘടനകളായതിനാൽ, സസ്യങ്ങളിൽ അവയുടെ സെലക്ടീവ് ഇൻഹിബിഷൻ കളനാശിനികൾക്ക് ഒരു പ്രധാന ആവശ്യകതയാണ്. ഉദാഹരണത്തിന്, ട്യൂബുലിനുമായി നേരിട്ട് ബന്ധിപ്പിക്കുകയും പോളിമറൈസേഷൻ തടയുകയും ചെയ്യുന്ന ഒരു മൈക്രോട്യൂബ്യൂൾ ഡിപോളിമറൈസിംഗ് ഏജന്റായ പ്രൊപിസാമൈഡ്, മൃഗകോശങ്ങൾക്ക് കുറഞ്ഞ വിഷാംശം ഉള്ളതിനാൽ ഒരു കളനാശിനിയായി ഉപയോഗിക്കുന്നു24. ഡിസോപിറാമൈഡിൽ നിന്ന് വ്യത്യസ്തമായി, അനുബന്ധ ബെൻസാമൈഡുകൾക്ക് വ്യത്യസ്ത ലക്ഷ്യ സവിശേഷതകൾ ഉണ്ട്. സസ്യ മൈക്രോട്യൂബ്യൂളുകൾക്ക് പുറമേ, RH-4032 അല്ലെങ്കിൽ ബെൻസോക്സാമൈഡ് യഥാക്രമം മൃഗകോശങ്ങളുടെയോ ഒമൈസെറ്റുകളുടെയോ മൈക്രോട്യൂബ്യൂളുകളെ തടയുന്നു, കൂടാതെ കുറഞ്ഞ ഫൈറ്റോടോക്സിസിറ്റി കാരണം സാലിലാമൈഡ് ഒരു കുമിൾനാശിനിയായി ഉപയോഗിക്കുന്നു25,26,27. പുതുതായി കണ്ടെത്തിയ കരടിയും അതിന്റെ ഡെറിവേറ്റീവുകളും സസ്യങ്ങൾക്കെതിരെ സെലക്ടീവ് സൈറ്റോടോക്സിസിറ്റി പ്രകടിപ്പിക്കുന്നു, എന്നാൽ കൂടുതൽ പരിഷ്കാരങ്ങൾ അവയുടെ ലക്ഷ്യ സവിശേഷതയെ മാറ്റിയേക്കാം, ഇത് രോഗകാരിയായ ഫംഗസുകളുടെയോ ഒമൈസെറ്റുകളുടെയോ നിയന്ത്രണത്തിന് അധിക ഡെറിവേറ്റീവുകൾ നൽകുമെന്നത് ശ്രദ്ധിക്കേണ്ടതാണ്.
ഉർബെനോണിക് ആസിഡിന്റെയും അതിന്റെ ഡെറിവേറ്റീവുകളുടെയും അതുല്യമായ ഗുണങ്ങൾ കളനാശിനികളായി വികസിപ്പിക്കുന്നതിനും ഗവേഷണ ഉപകരണങ്ങളായി ഉപയോഗിക്കുന്നതിനും ഉപയോഗപ്രദമാണ്. സസ്യകോശത്തിന്റെ ആകൃതി നിയന്ത്രിക്കുന്നതിൽ സൈറ്റോസ്കെലിറ്റണിന്റെ പ്രാധാന്യം വ്യാപകമായി അംഗീകരിക്കപ്പെട്ടിട്ടുണ്ട്. രൂപാന്തരണം ശരിയായി നിയന്ത്രിക്കുന്നതിന് മൈക്രോട്യൂബ്യൂൾ ഡൈനാമിക്സിനെ നിയന്ത്രിച്ചുകൊണ്ട് സസ്യങ്ങൾ കോർട്ടിക്കൽ മൈക്രോട്യൂബ്യൂൾ ഓർഗനൈസേഷന്റെ സങ്കീർണ്ണമായ സംവിധാനങ്ങൾ വികസിപ്പിച്ചെടുത്തിട്ടുണ്ടെന്ന് മുൻകാല പഠനങ്ങൾ തെളിയിച്ചിട്ടുണ്ട്. മൈക്രോട്യൂബ്യൂൾ പ്രവർത്തനത്തിന്റെ നിയന്ത്രണത്തിന് ഉത്തരവാദികളായ ധാരാളം തന്മാത്രകൾ തിരിച്ചറിഞ്ഞിട്ടുണ്ട്, അനുബന്ധ ഗവേഷണം ഇപ്പോഴും നടന്നുകൊണ്ടിരിക്കുന്നു3,4,28. സസ്യകോശങ്ങളിലെ മൈക്രോട്യൂബ്യൂൾ ഡൈനാമിക്സിനെക്കുറിച്ചുള്ള നമ്മുടെ നിലവിലെ ധാരണ കോർട്ടിക്കൽ മൈക്രോട്യൂബ്യൂൾ ഓർഗനൈസേഷന്റെ സംവിധാനങ്ങളെ പൂർണ്ണമായി വിശദീകരിക്കുന്നില്ല. ഉദാഹരണത്തിന്, ഡിസോപിറാമൈഡിനും ഒറിസാലിനും മൈക്രോട്യൂബ്യൂളുകളെ ഡീപോളിമറൈസ് ചെയ്യാൻ കഴിയുമെങ്കിലും, ഡിസോപിറാമൈഡ് ഗുരുതരമായ വേരുകളുടെ വികലതയ്ക്ക് കാരണമാകുന്നു, അതേസമയം ഒറിസാലിന് താരതമ്യേന നേരിയ ഫലമേയുള്ളൂ. മാത്രമല്ല, മൈക്രോട്യൂബ്യൂളുകളെ സ്ഥിരപ്പെടുത്തുന്ന ട്യൂബുലിനിലെ മ്യൂട്ടേഷനുകൾ വേരുകളിൽ ഡെക്‌സ്ട്രോറോട്ടേഷനും കാരണമാകുന്നു, അതേസമയം മൈക്രോട്യൂബ്യൂൾ ഡൈനാമിക്സിനെ സ്ഥിരപ്പെടുത്തുന്ന പാക്ലിറ്റാക്സൽ അങ്ങനെ ചെയ്യുന്നില്ല. അതിനാൽ, ഉർസോളിക് ആസിഡിന്റെ തന്മാത്രാ ലക്ഷ്യങ്ങളെക്കുറിച്ചുള്ള പഠനവും തിരിച്ചറിയലും സസ്യ കോർട്ടിക്കൽ മൈക്രോട്യൂബുളുകളുടെ നിയന്ത്രണത്തെക്കുറിച്ച് പുതിയ ഉൾക്കാഴ്ചകൾ നൽകണം. അതുപോലെ, വികലമായ വളർച്ചയെ പ്രോത്സാഹിപ്പിക്കുന്നതിൽ ഫലപ്രദമായ ഡിസോപിറാമൈഡ് പോലുള്ള രാസവസ്തുക്കളുടെയും ഒറിസാലിൻ അല്ലെങ്കിൽ കുമാമോട്ടോറിക് ആസിഡ് പോലുള്ള ഫലപ്രദമല്ലാത്ത രാസവസ്തുക്കളുടെയും ഭാവി താരതമ്യങ്ങൾ വികലമായ വളർച്ച എങ്ങനെ സംഭവിക്കുന്നു എന്നതിനെക്കുറിച്ചുള്ള സൂചനകൾ നൽകും.
മറുവശത്ത്, പ്രതിരോധവുമായി ബന്ധപ്പെട്ട സൈറ്റോസ്‌കെലിറ്റൽ പുനഃക്രമീകരണങ്ങൾ ഉർസോണിക് ആസിഡിന്റെ സൈറ്റോടോക്സിസിറ്റി വിശദീകരിക്കുന്നതിനുള്ള മറ്റൊരു സാധ്യതയാണ്. ഒരു രോഗകാരിയുടെ അണുബാധയോ സസ്യകോശങ്ങളിലേക്ക് ഒരു എലിസിറ്റർ അവതരിപ്പിക്കുന്നതോ ചിലപ്പോൾ സൈറ്റോസ്കെലിറ്റണിന്റെ നാശത്തിനും തുടർന്നുള്ള കോശ മരണത്തിനും കാരണമാകുന്നു29. ഉദാഹരണത്തിന്, KAND ചികിത്സയിൽ സംഭവിക്കുന്നതിന് സമാനമായി, പുകയില കോശ മരണത്തിന് മുമ്പ് ഒമൈസെറ്റിൽ നിന്ന് ഉരുത്തിരിഞ്ഞ ക്രിപ്‌റ്റോക്‌സാന്തിൻ മൈക്രോട്യൂബുളുകളെയും ആക്റ്റിൻ ഫിലമെന്റുകളെയും തടസ്സപ്പെടുത്തുന്നതായി റിപ്പോർട്ട് ചെയ്യപ്പെട്ടിട്ടുണ്ട്30,31. ഉർസോണിക് ആസിഡ് പ്രേരിപ്പിക്കുന്ന പ്രതിരോധ പ്രതികരണങ്ങളും സെല്ലുലാർ പ്രതികരണങ്ങളും തമ്മിലുള്ള സമാനതകൾ, ക്രിപ്‌റ്റോക്‌സാന്തിനിനേക്കാൾ വേഗതയേറിയതും ശക്തവുമായ ഉർസോണിക് ആസിഡിന്റെ പ്രഭാവം പ്രകടമാണെങ്കിലും, അവ സാധാരണ സെല്ലുലാർ പ്രക്രിയകൾക്ക് കാരണമാകുമെന്ന് അനുമാനിക്കാൻ ഞങ്ങളെ പ്രേരിപ്പിച്ചു. എന്നിരുന്നാലും, ആക്റ്റിൻ ഫിലമെന്റുകളുടെ തടസ്സം സ്വയമേവയുള്ള കോശ മരണത്തെ പ്രോത്സാഹിപ്പിക്കുന്നുവെന്ന് പഠനങ്ങൾ തെളിയിച്ചിട്ടുണ്ട്, ഇത് എല്ലായ്പ്പോഴും മൈക്രോട്യൂബ്യൂൾ തടസ്സത്തോടൊപ്പമല്ല29. കൂടാതെ, ഉർസോണിക് ആസിഡ് ഡെറിവേറ്റീവുകൾ ചെയ്യുന്നതുപോലെ, രോഗകാരിയോ എലിസിറ്ററോ വികലമായ വേരുകളുടെ വളർച്ചയ്ക്ക് കാരണമാകുമോ എന്ന് കണ്ടറിയേണ്ടതുണ്ട്. അതിനാൽ, പ്രതിരോധ പ്രതികരണങ്ങളെയും സൈറ്റോസ്‌കെലിറ്റണിനെയും ബന്ധിപ്പിക്കുന്ന തന്മാത്രാ അറിവ് പരിഹരിക്കേണ്ട ഒരു ആകർഷകമായ പ്രശ്നമാണ്. അർസോണിക് ആസിഡുമായി ബന്ധപ്പെട്ട കുറഞ്ഞ തന്മാത്രാ ഭാര സംയുക്തങ്ങളുടെയും വ്യത്യസ്ത ശക്തികളുള്ള വിവിധ ഡെറിവേറ്റീവുകളുടെയും സാന്നിധ്യം ഉപയോഗപ്പെടുത്തുന്നതിലൂടെ, അവ അജ്ഞാത കോശ സംവിധാനങ്ങളെ ലക്ഷ്യം വയ്ക്കാനുള്ള അവസരങ്ങൾ നൽകിയേക്കാം.
മൈക്രോട്യൂബ്യൂൾ ഡൈനാമിക്സിനെ മോഡുലേറ്റ് ചെയ്യുന്ന പുതിയ സംയുക്തങ്ങളുടെ കണ്ടെത്തലും പ്രയോഗവും സസ്യകോശ ആകൃതി നിർണ്ണയത്തിന് അടിസ്ഥാനമായ സങ്കീർണ്ണമായ തന്മാത്രാ സംവിധാനങ്ങളെ അഭിസംബോധന ചെയ്യുന്നതിനുള്ള ശക്തമായ രീതികൾ നൽകും. ഈ സാഹചര്യത്തിൽ, മൈക്രോട്യൂബ്യൂളുകളെയും ആക്റ്റിൻ ഫിലമെന്റുകളെയും ബാധിക്കുകയും കോശ മരണത്തിന് കാരണമാവുകയും ചെയ്യുന്ന അടുത്തിടെ വികസിപ്പിച്ച സംയുക്തമായ ഉർമോട്ടോണിക് ആസിഡ്, മൈക്രോട്യൂബ്യൂൾ നിയന്ത്രണവും ഈ മറ്റ് സംവിധാനങ്ങളും തമ്മിലുള്ള ബന്ധം മനസ്സിലാക്കാൻ അവസരം നൽകിയേക്കാം. അതിനാൽ, ഉർബെനോണിക് ആസിഡ് ഉപയോഗിച്ചുള്ള രാസ, ജൈവ വിശകലനം സസ്യ സൈറ്റോസ്കെലിറ്റണിനെ നിയന്ത്രിക്കുന്ന തന്മാത്രാ നിയന്ത്രണ സംവിധാനങ്ങൾ മനസ്സിലാക്കാൻ നമ്മെ സഹായിക്കും.
2% (w/v) ഗാലക്ടോസ്, 2% (w/v) എസെൻസ് പേസ്റ്റ്, 1% (w/v) ബാക്ടോ കോമ്പോസിഷൻ എന്നിവ അടങ്ങിയ 110 മില്ലി വിത്ത് മീഡിയം അടങ്ങിയ 500 മില്ലി ബാഫിൾഡ് എർലെൻമെയർ ഫ്ലാസ്കിലേക്ക് S. werraensis MK493-CF1 കുത്തിവയ്ക്കുക. -സോയിട്ടൺ (തെർമോ ഫിഷർ സയന്റിഫിക്, ഇൻക്.), 0.5% (w/v) കോൺ എക്സ്ട്രാക്റ്റ് (KOGOSCH Co., Ltd., ജപ്പാൻ), 0.2% (w/v) (NH4)2SO4, 0.2% CaCO3 എന്നിവ ഡീയോണൈസ് ചെയ്ത വെള്ളത്തിൽ. (വന്ധ്യംകരണത്തിന് മുമ്പ് pH 7.4). വിത്ത് കൾച്ചറുകൾ 27°C താപനിലയിൽ ഒരു റോട്ടറി ഷേക്കറിൽ (180 rpm) 2 ദിവസത്തേക്ക് ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്തു. സോളിഡ് സ്റ്റേറ്റ് ഫെർമെന്റേഷൻ വഴി ഉത്പാദന കൃഷി. വിത്ത് കൾച്ചർ (7 മില്ലി) 15 ഗ്രാം അമർത്തിയ ബാർലിയും (MUSO Co., Ltd., ജപ്പാൻ) 25 ഗ്രാം ഡീയോണൈസ് ചെയ്ത വെള്ളവും (വന്ധ്യംകരണത്തിന് മുമ്പ് pH ക്രമീകരിച്ചിട്ടില്ല) അടങ്ങിയ 40 ഗ്രാം ഉൽപാദന മാധ്യമം അടങ്ങിയ 500 മില്ലി K-1 ഫ്ലാസ്കിലേക്ക് മാറ്റി. 14 ദിവസത്തേക്ക് ഇരുട്ടിൽ 30°C താപനിലയിൽ അഴുകൽ നടത്തി. അഴുകൽ വസ്തു 40 മില്ലി/കുപ്പി EtOH ഉപയോഗിച്ച് വേർതിരിച്ചെടുത്ത് സെൻട്രിഫ്യൂജ് ചെയ്തു (1500 ഗ്രാം, 4°C, 10 മിനിറ്റ്). കൾച്ചർ സൂപ്പർനേറ്റന്റ് (60 മില്ലി) 10% MeOH/EtOAc മിശ്രിതം ഉപയോഗിച്ച് വേർതിരിച്ചെടുത്തു. കുറഞ്ഞ മർദ്ദത്തിൽ ഒരു അവശിഷ്ടം (59.5 മില്ലിഗ്രാം) ലഭിക്കുന്നതിനായി ജൈവ പാളി ബാഷ്പീകരിക്കപ്പെട്ടു, ഇത് ഗ്രേഡിയന്റ് എല്യൂഷൻ (0–10 മിനിറ്റ്: 90%) ഉപയോഗിച്ച് റിവേഴ്സ് ഫേസ് കോളത്തിൽ (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID 10 mm × നീളം 250 mm) H2O/CH3CN, 10–35 മിനിറ്റ്: 90% H2O/CH3CN മുതൽ 70% H2O/CH3CN (ഗ്രേഡിയന്റ്), 35–45 മിനിറ്റ്: 90% H2O/EtOH, 45–155 മിനിറ്റ്: 90% H2O/EtOH മുതൽ 100% EtOH (ഗ്രേഡിയന്റ് (ഗ്രേഡിയന്റ്), 155–200 മിനിറ്റ്: 100% EtOH) 1.5 മില്ലി/മിനിറ്റ് എന്ന ഫ്ലോ റേറ്റിൽ, കൊമമോണമൈഡ് (1, 36.0 മില്ലിഗ്രാം) ഒരു വെളുത്ത അമോർഫസ് പൊടിയായി വേർതിരിച്ചു.
കുമാമോട്ടോഅമൈഡ്(1); 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6.93 (t, J = 2.5 Hz, 1H), 6.76 (dd, J = 4.3, 1.8 Hz 1H), 6.05 (t, J = 3.8 Hz, 1H). ), 4.08 (s, 3H); 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161.1, 121.0, 119.9, 112.2, 105.0, 68.3; ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ കണക്കാക്കിയ മൂല്യം: 141.0659, അളന്ന മൂല്യം: 141.0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 cm–1.
കൊളംബിയ വിത്തുകൾ (Col-0) അറബിഡോപ്സിസ് ബയോളജിക്കൽ റിസോഴ്‌സ് സെന്ററിൽ (ABRC) നിന്ന് ഗവേഷണ ഉപയോഗത്തിനുള്ള അനുമതിയോടെ ലഭിച്ചു. കോൾ-0 വിത്തുകൾ ഞങ്ങളുടെ ലബോറട്ടറി സാഹചര്യങ്ങളിൽ പ്രചരിപ്പിക്കുകയും പരിപാലിക്കുകയും കാട്ടുതരം അറബിഡോപ്സിസ് സസ്യങ്ങളായി ഉപയോഗിക്കുകയും ചെയ്തു. അറബിഡോപ്സിസ് വിത്തുകൾ ഉപരിതലത്തിൽ അണുവിമുക്തമാക്കി, 2% സുക്രോസ് (ഫ്യൂജിഫിലിം വാക്കോ പ്യുവർ കെമിക്കൽ), 0.05% (w/v) 2-(4-മോർഫോളിനോ) എഥനസൾഫോണിക് ആസിഡ് (MES) (ഫ്യൂജിഫിലിം വാക്കോ പ്യുവർ കെമിക്കൽ). ) 1.5% അഗർ (ഫ്യൂജിഫിലിം വാക്കോ പ്യുവർ കെമിക്കൽ), pH 5.7, 23 °C, സ്ഥിരമായ വെളിച്ചം എന്നിവ അടങ്ങിയ പകുതി ശക്തിയുള്ള മുറാഷിഗെ, സ്കൂഗ് മീഡിയത്തിൽ സംസ്കരിച്ചു. phs1-1 മ്യൂട്ടന്റിന്റെ വിത്തുകൾ ടി. ഹാഷിമോട്ടോ (നാര ഇൻസ്റ്റിറ്റ്യൂട്ട് ഓഫ് സയൻസ് ആൻഡ് ടെക്നോളജി) നൽകി.
SR-1 സ്ട്രെയിനിന്റെ വിത്തുകൾ ടി. ഹാഷിമോട്ടോ (നാര ഇൻസ്റ്റിറ്റ്യൂട്ട് ഓഫ് സയൻസ് ആൻഡ് ടെക്നോളജി) നൽകിയതും കാട്ടുതരം പുകയില സസ്യങ്ങളായി ഉപയോഗിച്ചിരുന്നതുമാണ്. പുകയില വിത്തുകൾ ഉപരിതലത്തിൽ അണുവിമുക്തമാക്കി മുളയ്ക്കുന്നത് പ്രോത്സാഹിപ്പിക്കുന്നതിനായി മൂന്ന് രാത്രികൾ അണുവിമുക്തമാക്കിയ വെള്ളത്തിൽ മുക്കിവച്ചു, തുടർന്ന് 2% സുക്രോസ്, 0.05% (w/v) MES, 0.8% ജെല്ലൻ ഗം (ഫ്യൂജിഫിലിം വാക്കോ പ്യുവർ കെമിക്കൽ) മുറാഷിഗെ., സ്കൂഗ് മീഡിയം) എന്നിവ അടങ്ങിയ പകുതി ശക്തിയുള്ള ലായനിയിൽ 5.7 pH ഉള്ളതും 23°C താപനിലയിൽ സ്ഥിരമായ വെളിച്ചത്തിൽ ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്തതുമാണ്.
ക്യോട്ടോ സർവകലാശാലയിലെ ടി. കൊച്ചിയാണ് സ്ട്രെയിൻ ടാക്ക്-1 നൽകിയത്, ലിവർവോർട്ട് പഠനത്തിനുള്ള സ്റ്റാൻഡേർഡ് പരീക്ഷണ യൂണിറ്റായി ഇത് ഉപയോഗിച്ചു. വന്ധ്യംകരിച്ച സംസ്കരിച്ച സസ്യങ്ങളിൽ നിന്നാണ് ജെമ്മ ലഭിച്ചത്, തുടർന്ന് 1% സുക്രോസും 0.3% ജെല്ലൻ ഗമ്മും അടങ്ങിയ ഗാംബോർഗ് ബി 5 മീഡിയത്തിൽ (ഫ്യൂജിഫിലിം വാക്കോ പ്യുവർ കെമിക്കൽ) പൂശി തുടർച്ചയായ വെളിച്ചത്തിൽ 23°C താപനിലയിൽ ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്തു.
പുകയില BY-2 സെല്ലുകൾ (നിക്കോട്ടിയാന ടാബകം എൽ. സിവി. ബ്രൈറ്റ് യെല്ലോ 2) എസ്. ഹസേസാവ (ടോക്കിയോ സർവകലാശാല) നൽകി. പരിഷ്കരിച്ച ലിൻസ്മിയർ, സ്കൂഗ് മീഡിയം എന്നിവയിൽ BY-2 സെല്ലുകൾ 95 മടങ്ങ് നേർപ്പിക്കുകയും ആഴ്ചതോറും 2,4-ഡൈക്ലോറോഫെനോക്സിയാസെറ്റിക് ആസിഡ് 32 ഉപയോഗിച്ച് സപ്ലിമെന്റ് ചെയ്യുകയും ചെയ്തു. ഇരുട്ടിൽ 27°C-ൽ 130 rpm-ൽ ഒരു റോട്ടറി ഷേക്കറിൽ സെൽ സസ്പെൻഷൻ കലർത്തി. പുതിയ മീഡിയത്തിന്റെ 10 മടങ്ങ് വോളിയം ഉപയോഗിച്ച് സെല്ലുകൾ കഴുകി അതേ മീഡിയത്തിൽ വീണ്ടും സസ്പെൻഡ് ചെയ്യുക. കോളിഫ്ലവർ മൊസൈക് വൈറസ് 35S പ്രൊമോട്ടറിന് കീഴിലുള്ള മൈക്രോട്യൂബ്യൂൾ മാർക്കർ TagRFP-TUA6 അല്ലെങ്കിൽ ആക്റ്റിൻ ഫിലമെന്റ് മാർക്കർ GFP-ABD2 സ്ഥിരമായി പ്രകടിപ്പിക്കുന്ന BY-2 ട്രാൻസ്ജെനിക് സെൽ ലൈനുകൾ വിവരിച്ചതുപോലെ ജനറേറ്റ് ചെയ്തു33,34,35. യഥാർത്ഥ BY-2 സെൽ ലൈനിന് ഉപയോഗിക്കുന്ന നടപടിക്രമങ്ങൾക്ക് സമാനമായ നടപടിക്രമങ്ങൾ ഉപയോഗിച്ച് ഈ സെൽ ലൈനുകൾ പരിപാലിക്കാനും സമന്വയിപ്പിക്കാനും കഴിയും.
5% CO2 ഉപയോഗിച്ച് 37°C ഇൻകുബേറ്ററിൽ 10% ഫീറ്റൽ ബോവിൻ സെറം, 1.2 U/ml പെൻസിലിൻ, 1.2 μg/ml സ്ട്രെപ്റ്റോമൈസിൻ എന്നിവ ചേർത്ത ഡൽബെക്കോയുടെ മോഡിഫൈഡ് ഈഗിൾസ് മീഡിയം (DMEM) (ലൈഫ് ടെക്നോളജീസ്)-ൽ HeLa കോശങ്ങൾ കൾച്ചർ ചെയ്തു.
ഈ കൈയെഴുത്തുപ്രതിയിൽ വിവരിച്ചിരിക്കുന്ന എല്ലാ പരീക്ഷണങ്ങളും ജാപ്പനീസ് ജൈവ സുരക്ഷാ ചട്ടങ്ങളും മാർഗ്ഗനിർദ്ദേശങ്ങളും അനുസരിച്ചാണ് നടത്തിയത്.
ഡൈമെഥൈൽ സൾഫോക്സൈഡിൽ (DMSO; ഫ്യൂജിഫിലിം വാക്കോ പ്യുവർ കെമിക്കൽ) സ്റ്റോക്ക് ലായനികളായി സംയുക്തങ്ങൾ ലയിപ്പിച്ച് അറബിഡോപ്സിസിന് MS മീഡിയത്തിലും ലിവർവോർട്ടിന് പുകയിലയിലോ ഗാംബോർഗ് B5 മീഡിയത്തിലോ ലയിപ്പിച്ചു. വേരുകളുടെ വളർച്ച തടയൽ പരിശോധനയ്ക്കായി, സൂചിപ്പിച്ച സംയുക്തങ്ങൾ അല്ലെങ്കിൽ DMSO അടങ്ങിയ അഗർ മീഡിയത്തിൽ ഒരു പ്ലേറ്റിൽ 10 ൽ കൂടുതൽ വിത്തുകൾ വിതച്ചു. വിത്തുകൾ 7 ദിവസത്തേക്ക് ഒരു വളർച്ചാ ചേമ്പറിൽ ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്തു. തൈകളുടെ ഫോട്ടോ എടുത്ത് വേരുകളുടെ നീളം അളന്നു. അറബിഡോപ്സിസ് മുളയ്ക്കൽ പരിശോധനയ്ക്കായി, 200 μM സംയുക്തം അല്ലെങ്കിൽ DMSO അടങ്ങിയ അഗർ മീഡിയത്തിൽ ഒരു പ്ലേറ്റിൽ 48 വിത്തുകൾ വിതച്ചു. അറബിഡോപ്സിസ് വിത്തുകൾ ഒരു വളർച്ചാ ചേമ്പറിൽ വളർത്തി, മുളച്ചതിന് 7 ദിവസത്തിന് ശേഷം (dag) മുളച്ച തൈകളുടെ എണ്ണം കണക്കാക്കി. പുകയില മുളയ്ക്കൽ പരിശോധനയ്ക്കായി, 200 μM KAND അല്ലെങ്കിൽ DMSO അടങ്ങിയ അഗർ മീഡിയത്തിൽ ഒരു പ്ലേറ്റിൽ 24 വിത്തുകൾ വിതച്ചു. പുകയില വിത്തുകൾ ഒരു വളർച്ചാ ചേമ്പറിൽ വളർത്തി, 14 ദിവസത്തിനുശേഷം മുളച്ച തൈകളുടെ എണ്ണം കണക്കാക്കി. ലിവർവോർട്ട് വളർച്ചാ തടസ്സ പരിശോധനയ്ക്കായി, ഓരോ പ്ലേറ്റിൽ നിന്നും 9 ഭ്രൂണങ്ങൾ KAND അല്ലെങ്കിൽ DMSO യുടെ സൂചിപ്പിച്ച സാന്ദ്രത അടങ്ങിയ അഗർ മീഡിയത്തിൽ പൂശുകയും 14 ദിവസത്തേക്ക് ഒരു വളർച്ചാ ചേമ്പറിൽ ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്യുകയും ചെയ്തു.
റൂട്ട് മെറിസ്റ്റം ഓർഗനൈസേഷൻ ദൃശ്യവൽക്കരിക്കുന്നതിന് 5 mg/ml പ്രൊപ്പിഡിയം അയഡൈഡ് (PI) ചേർത്ത തൈകൾ ഉപയോഗിക്കുക. TCS SPE കോൺഫോക്കൽ ലേസർ സ്കാനിംഗ് മൈക്രോസ്കോപ്പ് (ലൈക്ക മൈക്രോസിസ്റ്റംസ്) ഉപയോഗിച്ച് ഫ്ലൂറസെൻസ് മൈക്രോസ്കോപ്പി വഴി PI സിഗ്നലുകൾ നിരീക്ഷിച്ചു.
മലാമിയും ബെൻഫെയും വിവരിച്ച പ്രോട്ടോക്കോൾ അനുസരിച്ച് വേരുകളുടെ ഹിസ്റ്റോകെമിക്കൽ സ്റ്റെയിനിംഗ് β-ഗ്ലൂക്കുറോണിഡേസ് (GUS) ഉപയോഗിച്ച് നടത്തി. തൈകൾ രാത്രി മുഴുവൻ 90% അസെറ്റോണിൽ ഉറപ്പിച്ചു, 0.5 mg/ml 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-d-glucuronic ആസിഡ് GUS ബഫറിൽ 1 മണിക്കൂർ സ്റ്റെയിൻ ചെയ്ത് ഒരു ഹൈഡ്രേറ്റഡ് ക്ലോറൽഡിഹൈഡ് ലായനിയിൽ വച്ചു. (8 ഗ്രാം ക്ലോറൽ ഹൈഡ്രേറ്റ്, 2 മില്ലി വെള്ളം, 1 മില്ലി ഗ്ലിസറോൾ) ആക്സിയോ ഇമേജർ M1 മൈക്രോസ്കോപ്പ് (കാൾ സീസ്) ഉപയോഗിച്ച് ഡിഫറൻഷ്യൽ ഇന്റർഫറൻസ് കോൺട്രാസ്റ്റ് മൈക്രോസ്കോപ്പി ഉപയോഗിച്ച് നിരീക്ഷിച്ചു.
ലംബമായി സ്ഥാപിച്ച പ്ലേറ്റുകളിൽ വളർത്തിയ 7 ദിവസം പ്രായമുള്ള തൈകളിലാണ് വേര് കോണുകൾ അളന്നത്. ആറാം ഘട്ടത്തിൽ വിവരിച്ചിരിക്കുന്നതുപോലെ ഗുരുത്വാകർഷണ വെക്റ്ററിന്റെ ദിശയിൽ നിന്ന് വേരിന്റെ കോൺ അളക്കുക.
പ്രോട്ടോക്കോളിൽ ചെറിയ മാറ്റങ്ങൾ വരുത്തിയുകൊണ്ട് കോർട്ടിക്കൽ മൈക്രോട്യൂബ്യൂളുകളുടെ ക്രമീകരണം വിവരിച്ചതുപോലെ നിരീക്ഷിക്കപ്പെട്ടു 37. ആന്റി-β-ട്യൂബുലിൻ ആന്റിബോഡി (KMX-1, മെർക്ക് മില്ലിപോർ: MAB3408), അലക്സാ ഫ്ലൂർ 488-കൺജഗേറ്റഡ് ആന്റി-മൗസ് IgG (തെർമോ ഫിഷർ സയന്റിഫിക്: A32723) എന്നിവ യഥാക്രമം 1:1000, 1:100 ഡില്യൂഷനുകളിൽ പ്രാഥമിക, ദ്വിതീയ ആന്റിബോഡികളായി ഉപയോഗിച്ചു. TCS SPE കൺഫോക്കൽ ലേസർ സ്കാനിംഗ് മൈക്രോസ്കോപ്പ് (ലൈക്ക മൈക്രോസിസ്റ്റംസ്) ഉപയോഗിച്ചാണ് ഫ്ലൂറസെൻസ് ചിത്രങ്ങൾ നേടിയത്. Z-സ്റ്റാക്ക് ഇമേജുകൾ നേടുകയും നിർമ്മാതാവിന്റെ നിർദ്ദേശങ്ങൾക്കനുസരിച്ച് പരമാവധി തീവ്രത പ്രൊജക്ഷനുകൾ സൃഷ്ടിക്കുകയും ചെയ്യുക.
നിർമ്മാതാവിന്റെ നിർദ്ദേശങ്ങൾക്കനുസൃതമായി സെൽ കൗണ്ടിംഗ് കിറ്റ് 8 (ഡോജിൻഡോ) ഉപയോഗിച്ച് HeLa സെൽ വ്യാപന പരിശോധന നടത്തി.
600 nm (OD600) ൽ ഒരു സ്പെക്ട്രോഫോട്ടോമീറ്റർ ഉപയോഗിച്ച് കൾച്ചറിലെ കോശ സാന്ദ്രത അളക്കുന്നതിലൂടെ E. coli DH5α യുടെ വളർച്ച വിശകലനം ചെയ്തു.
CSU-X1 കൺഫോക്കൽ സ്കാനിംഗ് ഉപകരണം (യോകോഗാവ), ഒരു sCMOS ക്യാമറ (സൈല, ആൻഡോർ ടെക്നോളജി) എന്നിവ ഘടിപ്പിച്ച ഒരു ഫ്ലൂറസെൻസ് മൈക്രോസ്കോപ്പ് ഉപയോഗിച്ച് ട്രാൻസ്ജെനിക് BY-2 കോശങ്ങളിലെ സൈറ്റോസ്കെലെറ്റൽ ഓർഗനൈസേഷൻ നിരീക്ഷിച്ചു. ഇമേജ് വിശകലനം വഴി സൈറ്റോസ്കെലെറ്റൽ സാന്ദ്രത വിലയിരുത്തി, ഇത് ഇമേജ്ജെ സോഫ്റ്റ്‌വെയർ ഉപയോഗിച്ച് കോൺഫോക്കൽ ഇമേജുകളിലെ സൈറ്റോസ്കെലെറ്റൽ പിക്സലുകൾക്കിടയിൽ സൈറ്റോസ്കെലെറ്റൽ പിക്സലുകളുടെ ശതമാനം കണക്കാക്കി38,39.
BY-2 കോശങ്ങളിലെ കോശ മരണം കണ്ടെത്തുന്നതിന്, സെൽ സസ്പെൻഷന്റെ ഒരു ഭാഗം 0.05% ഇവാൻസ് ബ്ലൂ ഉപയോഗിച്ച് 10 മിനിറ്റ് മുറിയിലെ താപനിലയിൽ ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്തു. മൃതകോശങ്ങളുടെ സെലക്ടീവ് ഇവാൻസ് ബ്ലൂ സ്റ്റെയിനിംഗ്, കേടുകൂടാത്ത പ്ലാസ്മ മെംബ്രൺ വഴി പ്രായോഗിക കോശങ്ങളിൽ നിന്ന് ഡൈ പുറത്തെടുക്കുന്നതിനെ ആശ്രയിച്ചിരിക്കുന്നു. ഒരു ബ്രൈറ്റ്-ഫീൽഡ് മൈക്രോസ്കോപ്പ് (BX53, ഒളിമ്പസ്) ഉപയോഗിച്ച് സ്റ്റെയിൻഡ് സെല്ലുകൾ നിരീക്ഷിച്ചു.
37°C ലും 5% CO2 ലും ഈർപ്പമുള്ള ഇൻകുബേറ്ററിൽ 10% FBS ചേർത്തുകൊണ്ട് DMEM-ൽ HeLa സെല്ലുകൾ വളർത്തി. 37°C-ൽ 6 മണിക്കൂർ 100 μM KAND 11, കുമമോണാമിക് ആസിഡ് 6, കുമമോണാമൈഡ് 1, 100 ng/ml കോൾസെമിഡ് (Gibco), അല്ലെങ്കിൽ 100 ng/ml നോകോഡ്മേസ് (സിഗ്മ) എന്നിവ ഉപയോഗിച്ച് കോശങ്ങളെ പരിചരിച്ചു. കോശങ്ങൾ 10 മിനിറ്റ് MetOH ഉപയോഗിച്ചും പിന്നീട് മുറിയിലെ താപനിലയിൽ 5 മിനിറ്റ് അസറ്റേറ്റും ഉപയോഗിച്ച് ഉറപ്പിച്ചു. 0.5% BSA/PBS-ൽ ലയിപ്പിച്ച β-ട്യൂബുലിൻ പ്രൈമറി ആന്റിബോഡി (1D4A4, പ്രോട്ടീൻടെക്: 66240-1) ഉപയോഗിച്ച് 2 മണിക്കൂർ സ്ഥിരമായ കോശങ്ങളെ ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്തു, TBST ഉപയോഗിച്ച് 3 തവണ കഴുകി, തുടർന്ന് അലക്സാ ഫ്ലൂറിൻ ആട് ആന്റിബോഡി ഉപയോഗിച്ച് ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്തു. 488 1 മണിക്കൂർ. – മൗസ് IgG (തെർമോ ഫിഷർ സയന്റിഫിക്: A11001) ഉം 15 ng/ml 4′,6-ഡയമിഡിനോ-2-ഫെനൈലിൻഡോൾ (DAPI) ഉം 0.5% BSA/PBS-ൽ ലയിപ്പിച്ചത്. TBST ഉപയോഗിച്ച് മൂന്ന് തവണ കഴുകിയ ശേഷം, ഒരു നിക്കോൺ എക്ലിപ്സ് Ti-E വിപരീത മൈക്രോസ്കോപ്പിൽ കറ പുരണ്ട കോശങ്ങൾ നിരീക്ഷിക്കപ്പെട്ടു. മെറ്റാമോർഫ് സോഫ്റ്റ്‌വെയർ (മോളിക്യുലാർ ഡിവൈസുകൾ) ഉപയോഗിച്ച് തണുപ്പിച്ച ഹമാമത്സു ORCA-R2 CCD ക്യാമറ ഉപയോഗിച്ച് ചിത്രങ്ങൾ പകർത്തി.
പോസ്റ്റ് സമയം: ജൂൺ-17-2024