പൈൻ നിമാവിര രോഗത്തിന് കാരണമാകുന്ന അയോഡിൻ, അവെർമെക്റ്റിൻ എന്നിവയുടെ വിലയിരുത്തൽ.

പൈൻ വന ആവാസവ്യവസ്ഥയിൽ ഗുരുതരമായ സാമ്പത്തിക നഷ്ടം വരുത്തിവയ്ക്കുന്ന ഒരു ക്വാറന്റൈൻ മൈഗ്രേറ്ററി എൻഡോപാരസൈറ്റാണ് പൈൻ നിമാവിരകൾ. പൈൻ നിമാവിരകൾക്കെതിരായ ഹാലോജനേറ്റഡ് ഇൻഡോളുകളുടെ നിമാവിരനാശക പ്രവർത്തനത്തെയും അവയുടെ പ്രവർത്തനരീതിയെയും ഈ പഠനം അവലോകനം ചെയ്യുന്നു. പൈൻ നിമാവിരകൾക്കെതിരായ 5-അയോഡോഇൻഡോളിന്റെയും അവെർമെക്റ്റിന്റെയും (പോസിറ്റീവ് നിയന്ത്രണം) നിമാവിരനാശക പ്രവർത്തനങ്ങൾ സമാനവും കുറഞ്ഞ സാന്ദ്രതയിൽ (10 μg/mL) ഉയർന്നതുമായിരുന്നു. 5-അയോഡോഇൻഡോൾ ഫലഭൂയിഷ്ഠത, പ്രത്യുൽപാദന പ്രവർത്തനം, ഭ്രൂണ, ലാർവ മരണനിരക്ക്, ലോക്കോമോട്ടർ സ്വഭാവം എന്നിവ കുറച്ചു. അകശേരുക്കൾക്ക് പ്രത്യേകമായി ഗ്ലൂട്ടാമേറ്റ്-ഗേറ്റഡ് ക്ലോറൈഡ് ചാനൽ റിസപ്റ്ററുകളുമായുള്ള ലിഗാൻഡുകളുടെ തന്മാത്രാ ഇടപെടലുകൾ അവെർമെക്റ്റിൻ പോലെ 5-അയോഡോഇൻഡോൾ റിസപ്റ്റർ സജീവ സൈറ്റുമായി ശക്തമായി ബന്ധിപ്പിക്കുന്നു എന്ന ധാരണയെ പിന്തുണയ്ക്കുന്നു. അസാധാരണമായ അവയവ തകർച്ച/ചുരുക്കൽ, വർദ്ധിച്ച വാക്യൂളൈസേഷൻ എന്നിവയുൾപ്പെടെ നെമറ്റോഡുകളിൽ വിവിധ ഫിനോടൈപ്പിക് രൂപഭേദം വരുത്തുന്നതിനും 5-അയോഡോഇൻഡോൾ കാരണമായി. നെമറ്റോഡ് മെത്തിലേഷൻ-മധ്യസ്ഥ മരണത്തിൽ വാക്യൂളുകൾക്ക് ഒരു പങ്കു വഹിക്കാൻ കഴിയുമെന്ന് ഈ ഫലങ്ങൾ സൂചിപ്പിക്കുന്നു. പ്രധാനമായും, 5-അയോഡോയിൻഡോൾ രണ്ട് സസ്യ ഇനങ്ങൾക്കും (കാബേജ്, മുള്ളങ്കി) വിഷരഹിതമായിരുന്നു. അതിനാൽ, പാരിസ്ഥിതിക സാഹചര്യങ്ങളിൽ അയോഡോയിൻഡോൾ പ്രയോഗിക്കുന്നത് പൈൻ വാട്ടത്തിന്റെ പരിക്കുകൾ നിയന്ത്രിക്കുമെന്ന് ഈ പഠനം തെളിയിക്കുന്നു.
പൈൻ വുഡ് നെമറ്റോഡ് (ബർസാഫെലെഞ്ചസ് സൈലോഫിലസ്) പൈൻ വുഡ് നെമറ്റോഡുകളിൽ (PWN) പെടുന്നു, പൈൻ വന ആവാസവ്യവസ്ഥയ്ക്ക് ഗുരുതരമായ പാരിസ്ഥിതിക നാശം വരുത്തുന്നതായി അറിയപ്പെടുന്ന ദേശാടന എൻഡോപാരാസിറ്റിക് നെമറ്റോഡുകൾ 1. പൈൻ വുഡ് നെമറ്റോഡ് മൂലമുണ്ടാകുന്ന പൈൻ വിൽറ്റ് രോഗം (PWD) ഏഷ്യ, യൂറോപ്പ് എന്നിവയുൾപ്പെടെ നിരവധി ഭൂഖണ്ഡങ്ങളിൽ ഗുരുതരമായ പ്രശ്നമായി മാറുകയാണ്, വടക്കേ അമേരിക്കയിൽ, നെമറ്റോഡ് പരിചയപ്പെടുത്തിയ പൈൻ ഇനങ്ങളെ നശിപ്പിക്കുന്നു 1,2. പൈൻ മരങ്ങളുടെ നാശമാണ് ഒരു പ്രധാന സാമ്പത്തിക പ്രശ്നമാണ്, കൂടാതെ അതിന്റെ ആഗോള വ്യാപനത്തിന്റെ സാധ്യത ആശങ്കാജനകമാണ് 3. താഴെപ്പറയുന്ന പൈൻ ഇനങ്ങളെയാണ് സാധാരണയായി നെമറ്റോഡ് ആക്രമിക്കുന്നത്: പൈനസ് ഡെൻസിഫ്ലോറ, പൈനസ് സിൽവെസ്ട്രിസ്, പൈനസ് തൻബെർഗി, പൈനസ് കൊറൈയെൻസിസ്, പൈനസ് തൻബെർഗി, പൈനസ് തൻബെർഗി, പൈനസ് റേഡിയറ്റ 4. അണുബാധയ്ക്ക് ശേഷം ആഴ്ചകൾക്കോ ​​മാസങ്ങൾക്കോ ​​ഉള്ളിൽ പൈൻ മരങ്ങളെ കൊല്ലാൻ കഴിയുന്ന ഗുരുതരമായ രോഗമാണ് പൈൻ നെമറ്റോഡ്. കൂടാതെ, വിവിധ ആവാസവ്യവസ്ഥകളിൽ പൈൻ നെമറ്റോഡ് പൊട്ടിപ്പുറപ്പെടുന്നത് സാധാരണമാണ്, അതിനാൽ സ്ഥിരമായ അണുബാധ ശൃംഖലകൾ സ്ഥാപിക്കപ്പെട്ടിട്ടുണ്ട് 1.
സൂപ്പർഫാമിലിയായ അഫെലെൻചോയിഡ, ക്ലേഡ് 102.5 എന്നിവയിൽ ഉൾപ്പെടുന്ന ഒരു ക്വാറന്റൈൻ സസ്യ-പരാദ നിമാവിരയാണ് ബർസഫെലെഞ്ചസ് സൈലോഫിലസ്. നിമാവിരകൾ ഫംഗസുകളെ ഭക്ഷിക്കുകയും പൈൻ മരങ്ങളുടെ തടി കലകളിൽ പുനരുൽപ്പാദിപ്പിക്കുകയും ചെയ്യുന്നു, നാല് വ്യത്യസ്ത ലാർവ ഘട്ടങ്ങളായി വികസിക്കുന്നു: L1, L2, L3, L4, മുതിർന്ന വ്യക്തി1,6. ഭക്ഷ്യക്ഷാമത്തിന്റെ സാഹചര്യങ്ങളിൽ, പൈൻ നിമാവിരകൾ ഒരു പ്രത്യേക ലാർവ ഘട്ടത്തിലേക്ക് കടന്നുപോകുന്നു - ഡൗവർ, ഇത് അതിന്റെ വെക്റ്ററായ പൈൻ പുറംതൊലി വണ്ടിനെ (മോണോകാമസ് ആൾട്ടർനേറ്റസ്) പരാദമാക്കുകയും ആരോഗ്യമുള്ള പൈൻ മരങ്ങളിലേക്ക് മാറ്റുകയും ചെയ്യുന്നു. ആരോഗ്യമുള്ള ആതിഥേയരിൽ, നിമാവിരകൾ സസ്യകലകളിലൂടെ വേഗത്തിൽ കുടിയേറുകയും പാരൻചൈമറ്റസ് കോശങ്ങളെ ഭക്ഷിക്കുകയും ചെയ്യുന്നു, ഇത് അണുബാധയ്ക്ക് ശേഷം ഒരു വർഷത്തിനുള്ളിൽ നിരവധി ഹൈപ്പർസെൻസിറ്റിവിറ്റി പ്രതികരണങ്ങൾക്കും പൈൻ വാടിപ്പോകലിനും മരണത്തിനും കാരണമാകുന്നു1,7,8.
പൈൻ നിമാവിരകളുടെ ജൈവിക നിയന്ത്രണം വളരെക്കാലമായി ഒരു വെല്ലുവിളിയാണ്, 20-ാം നൂറ്റാണ്ട് മുതലുള്ള ക്വാറന്റൈൻ നടപടികൾ ഇതിന് ഉദാഹരണമാണ്. പൈൻ നിമാവിരകളെ നിയന്ത്രിക്കുന്നതിനുള്ള നിലവിലെ തന്ത്രങ്ങളിൽ പ്രധാനമായും രാസ ചികിത്സകൾ ഉൾപ്പെടുന്നു, അതിൽ മരം പുകയ്ക്കൽ, മരക്കൊമ്പുകളിൽ നിമാവിരകളെ നട്ടുപിടിപ്പിക്കൽ എന്നിവ ഉൾപ്പെടുന്നു. ഏറ്റവും സാധാരണയായി ഉപയോഗിക്കുന്ന നിമാവിരകൾ അവെർമെക്റ്റിൻ, അവെർമെക്റ്റിൻ ബെൻസോയേറ്റ് എന്നിവയാണ്, അവ അവെർമെക്റ്റിൻ കുടുംബത്തിൽ പെടുന്നു. ഈ വിലയേറിയ രാസവസ്തുക്കൾ പല നിമാവിരകൾക്കെതിരെയും വളരെ ഫലപ്രദമാണ്, കൂടാതെ പരിസ്ഥിതി സുരക്ഷിതമായി കണക്കാക്കപ്പെടുന്നു9. എന്നിരുന്നാലും, ഈ നിമാവിരകളുടെ ആവർത്തിച്ചുള്ള ഉപയോഗം തിരഞ്ഞെടുക്കൽ സമ്മർദ്ദം സൃഷ്ടിക്കുമെന്ന് പ്രതീക്ഷിക്കുന്നു, ഇത് മിക്കവാറും പ്രതിരോധശേഷിയുള്ള പൈൻ നിമാവിരകളുടെ ആവിർഭാവത്തിലേക്ക് നയിക്കും, ലെപ്റ്റിനോടാർസ ഡെസെംലിനേറ്റ, പ്ലൂട്ടെല്ല സൈലോസ്റ്റെല്ല, ട്രൈക്കോസ്ട്രോംഗൈലസ് കൊളുബ്രിഫോർമിസ്, ഓസ്റ്റെർടാഗിയ സർക്കംസിങ്ക്റ്റ തുടങ്ങിയ നിരവധി കീട കീടങ്ങൾക്ക് ഇത് തെളിയിക്കപ്പെട്ടിട്ടുണ്ട്. അവെർമെക്റ്റിൻസിനെതിരെ ക്രമേണ പ്രതിരോധം വികസിപ്പിച്ചെടുത്തിട്ടുണ്ട്10,11,12. അതിനാൽ, പിവിഡി നിയന്ത്രിക്കുന്നതിന് ബദൽ, ചെലവ് കുറഞ്ഞതും പരിസ്ഥിതി സൗഹൃദപരവുമായ നടപടികൾ കണ്ടെത്തുന്നതിന് പ്രതിരോധ രീതികൾ പതിവായി പഠിക്കുകയും നിമാവിരനാശിനികൾ തുടർച്ചയായി പരിശോധിക്കുകയും ചെയ്യേണ്ടതുണ്ട്. സമീപ ദശകങ്ങളിൽ, നിരവധി എഴുത്തുകാർ സസ്യ സത്ത്, അവശ്യ എണ്ണകൾ, ബാഷ്പീകരിക്കപ്പെടുന്ന വസ്തുക്കൾ എന്നിവ നിമാവിര നിയന്ത്രണ ഏജന്റുകളായി ഉപയോഗിക്കാൻ നിർദ്ദേശിച്ചിട്ടുണ്ട്13,14,15,16.
ഇന്റർസെല്ലുലാർ, ഇന്റർകിംഗ്ഡം സിഗ്നലിംഗ് തന്മാത്രയായ ഇൻഡോളിന്റെ നിമാവിനാശക പ്രവർത്തനം ഞങ്ങൾ അടുത്തിടെ കെയ്‌നോർഹാബ്ഡിറ്റിസ് എലിഗൻസ് 17-ൽ പ്രദർശിപ്പിച്ചു. സൂക്ഷ്മജീവ പരിസ്ഥിതിയിൽ ഇൻഡോൾ ഒരു വ്യാപകമായ ഇൻട്രാ സെല്ലുലാർ സിഗ്നലാണ്, സൂക്ഷ്മജീവ ശരീരശാസ്ത്രം, ബീജ രൂപീകരണം, പ്ലാസ്മിഡ് സ്ഥിരത, മയക്കുമരുന്ന് പ്രതിരോധം, ബയോഫിലിം രൂപീകരണം, വൈറലൻസ് 18, 19 എന്നിവയെ ബാധിക്കുന്ന നിരവധി പ്രവർത്തനങ്ങൾ നിയന്ത്രിക്കുന്നു. മറ്റ് രോഗകാരിയായ നിമാവിരകൾക്കെതിരായ ഇൻഡോളിന്റെയും അതിന്റെ ഡെറിവേറ്റീവുകളുടെയും പ്രവർത്തനം പഠിച്ചിട്ടില്ല. ഈ പഠനത്തിൽ, പൈൻ നിമാവിരകൾക്കെതിരായ 34 ഇൻഡോളുകളുടെ നിമാവിനാശക പ്രവർത്തനം ഞങ്ങൾ അന്വേഷിക്കുകയും മൈക്രോസ്കോപ്പി, ടൈം-ലാപ്സ് ഫോട്ടോഗ്രാഫി, മോളിക്യുലാർ ഡോക്കിംഗ് പരീക്ഷണങ്ങൾ എന്നിവ ഉപയോഗിച്ച് ഏറ്റവും ശക്തമായ 5-അയോഡോയിൻഡോളിന്റെ പ്രവർത്തനരീതി വ്യക്തമാക്കുകയും ചെയ്തു, കൂടാതെ ഒരു വിത്ത് മുളയ്ക്കൽ വിശകലനം ഉപയോഗിച്ച് സസ്യങ്ങളിൽ അതിന്റെ വിഷ ഫലങ്ങൾ വിലയിരുത്തി.
ഉയർന്ന സാന്ദ്രതയിലുള്ള ഇൻഡോളിന് (> 1.0 mM) നെമറ്റോഡുകളിൽ നിമാവിനാശക ഫലമുണ്ടെന്ന് മുമ്പ് റിപ്പോർട്ട് ചെയ്യപ്പെട്ടിട്ടുണ്ട്17. ഇൻഡോൾ അല്ലെങ്കിൽ 33 വ്യത്യസ്ത ഇൻഡോൾ ഡെറിവേറ്റീവുകൾ ഉപയോഗിച്ച് ബി. സൈലോഫിലസ് (മിക്സഡ് ലൈഫ് സ്റ്റേജുകൾ) 1 mM ൽ ചികിത്സിച്ചതിനുശേഷം, നിയന്ത്രണ, ചികിത്സിച്ച ഗ്രൂപ്പുകളിലെ ജീവനുള്ളതും മരിച്ചതുമായ നിമാവിനാശക പ്രവർത്തനങ്ങൾ എണ്ണിയാണ് ബി. സൈലോഫിലസിന്റെ മരണനിരക്ക് അളന്നത്. അഞ്ച് ഇൻഡോളുകൾ ഗണ്യമായ നിമാവിനാശക പ്രവർത്തനം കാണിച്ചു; ചികിത്സിക്കാത്ത നിയന്ത്രണ ഗ്രൂപ്പിന്റെ അതിജീവനം 24 മണിക്കൂറിനുശേഷം 95 ± 7% ആയിരുന്നു. പരീക്ഷിച്ച 34 ഇൻഡോളുകളിൽ, 1 mM ൽ 5-അയോഡോയിൻഡോളും 4-ഫ്ലൂറോയിൻഡോളും 100% മരണത്തിന് കാരണമായി, അതേസമയം 5,6-ഡിഫ്ലൂറോഇൻഡിഗോ, മെത്തിലിൻഡോൾ-7-കാർബോക്‌സിലേറ്റ്, 7-അയോഡോയിൻഡോൾ എന്നിവ ഏകദേശം 50% മരണത്തിന് കാരണമായി (പട്ടിക 1).
പൈൻ മര നിമറ്റോഡിന്റെ വാക്യൂൾ രൂപീകരണത്തിലും ഉപാപചയ പ്രവർത്തനത്തിലും 5-അയോഡോഇൻഡോളിന്റെ സ്വാധീനം. (എ) മുതിർന്ന ആൺ നിമറ്റോഡുകളിൽ അവെർമെക്റ്റിന്റെയും 5-അയോഡോഇൻഡോളിന്റെയും പ്രഭാവം, (ബി) എൽ1 ഘട്ട നിമറ്റോഡ് മുട്ടകൾ, (സി) ബി. സൈലോഫിലസിന്റെ മെറ്റബോളിസം, (ഐ) 0 മണിക്കൂറിൽ വാക്യൂളുകൾ നിരീക്ഷിക്കപ്പെട്ടില്ല, ചികിത്സയുടെ ഫലമായി (ii) വാക്യൂളുകൾ, (iii) ഒന്നിലധികം വാക്യൂളുകളുടെ ശേഖരണം, (iv) വാക്യൂളുകളുടെ വീക്കം, (v) വാക്യൂളുകളുടെ സംയോജനം, (vi) ഭീമൻ വാക്യൂളുകളുടെ രൂപീകരണം. ചുവന്ന അമ്പുകൾ വാക്യൂളുകളുടെ വീക്കത്തെയും, നീല അമ്പുകൾ വാക്യൂളുകളുടെ സംയോജനത്തെയും, കറുത്ത അമ്പുകൾ ഭീമൻ വാക്യൂളുകളെയുമാണ് സൂചിപ്പിക്കുന്നത്. സ്കെയിൽ ബാർ = 50 μm.
കൂടാതെ, പൈൻ നെമറ്റോഡുകളിലെ മീഥെയ്ൻ മൂലമുണ്ടാകുന്ന മരണത്തിന്റെ തുടർച്ചയായ പ്രക്രിയയും ഈ പഠനം വിവരിച്ചു (ചിത്രം 4C). മെത്തനോജെനിക് മരണം എന്നത് പ്രമുഖ സൈറ്റോപ്ലാസ്മിക് വാക്യൂളുകളുടെ ശേഖരണവുമായി ബന്ധപ്പെട്ട ഒരു അപ്പോപ്റ്റോട്ടിക് അല്ലാത്ത തരം കോശ മരണമാണ്27. പൈൻ നെമറ്റോഡുകളിൽ കാണപ്പെടുന്ന രൂപാന്തര വൈകല്യങ്ങൾ മീഥെയ്ൻ മൂലമുണ്ടാകുന്ന മരണത്തിന്റെ സംവിധാനവുമായി അടുത്ത ബന്ധമുള്ളതായി തോന്നുന്നു. വ്യത്യസ്ത സമയങ്ങളിലെ സൂക്ഷ്മ പരിശോധനയിൽ 5-അയോഡോയിൻഡോളുമായി (0.1 mM) 20 മണിക്കൂർ സമ്പർക്കം പുലർത്തിയതിന് ശേഷം ഭീമൻ വാക്യൂളുകൾ രൂപപ്പെട്ടതായി കാണിച്ചു. 8 മണിക്കൂർ ചികിത്സയ്ക്ക് ശേഷം മൈക്രോസ്കോപ്പിക് വാക്യൂളുകൾ നിരീക്ഷിക്കപ്പെട്ടു, 12 മണിക്കൂറിനു ശേഷം അവയുടെ എണ്ണം വർദ്ധിച്ചു. 14 മണിക്കൂറിനു ശേഷം നിരവധി വലിയ വാക്യൂളുകൾ നിരീക്ഷിക്കപ്പെട്ടു. 12-16 മണിക്കൂർ ചികിത്സയ്ക്ക് ശേഷം നിരവധി സംയോജിത വാക്യൂളുകൾ വ്യക്തമായി കാണപ്പെട്ടു, ഇത് മെത്തനോജെനിക് മരണ സംവിധാനത്തിന്റെ അടിസ്ഥാനം വാക്യൂൾ ഫ്യൂഷനാണെന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു. 20 മണിക്കൂറിനു ശേഷം, പുഴുവിലുടനീളം നിരവധി ഭീമൻ വാക്യൂളുകൾ കണ്ടെത്തി. സി. എലിഗൻസിലെ മെറ്റുവോസിസിന്റെ ആദ്യ റിപ്പോർട്ടിനെ ഈ നിരീക്ഷണങ്ങൾ പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നു.
5-അയോഡോഇൻഡോൾ ചികിത്സിച്ച വിരകളിൽ, വാക്യൂൾ അഗ്രഗേഷനും വിള്ളലും നിരീക്ഷിക്കപ്പെട്ടു (ചിത്രം 5), വിര വളയുന്നതും പരിസ്ഥിതിയിലേക്ക് വാക്യൂൾ പുറത്തുവിടുന്നതും ഇതിന് തെളിവാണ്. മുട്ടത്തോടിന്റെ മെംബ്രണിലും വാക്യൂൾ തടസ്സം നിരീക്ഷിക്കപ്പെട്ടു, ഇത് സാധാരണയായി വിരിയുന്ന സമയത്ത് L2 വഴി കേടുകൂടാതെ സംരക്ഷിക്കപ്പെടുന്നു (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം S2). വാക്യൂൾ രൂപീകരണത്തിന്റെയും സപ്പുറേഷൻ പ്രക്രിയയിലും ദ്രാവക ശേഖരണത്തിന്റെയും ഓസ്മോറെഗുലേറ്ററി പരാജയത്തിന്റെയും, അതുപോലെ റിവേഴ്‌സിബിൾ സെൽ പരിക്കിന്റെയും (RCI) പങ്കാളിത്തത്തെ ഈ നിരീക്ഷണങ്ങൾ പിന്തുണയ്ക്കുന്നു (ചിത്രം 5).
നിരീക്ഷിച്ച വാക്യൂൾ രൂപീകരണത്തിൽ അയോഡിൻറെ പങ്ക് അനുമാനിച്ചുകൊണ്ട്, സോഡിയം അയഡിഡ് (NaI), പൊട്ടാസ്യം അയഡിഡ് (KI) എന്നിവയുടെ നിമാവിനാശക പ്രവർത്തനം ഞങ്ങൾ അന്വേഷിച്ചു. എന്നിരുന്നാലും, സാന്ദ്രതകളിൽ (0.1, 0.5 അല്ലെങ്കിൽ 1 mM), അവ നിമാവിനാശക നിലനിൽപ്പിനെയോ വാക്യൂൾ രൂപീകരണത്തെയോ ബാധിച്ചില്ല (അനുബന്ധ ചിത്രം. S5), എന്നിരുന്നാലും 1 mM KI ന് നേരിയ നിമാവിനാശക ഫലമുണ്ടായിരുന്നു. മറുവശത്ത്, 5-അയോഡോയിൻഡോൾ പോലെ 7-അയോഡോയിൻഡോൾ (1 അല്ലെങ്കിൽ 2 mM), ഒന്നിലധികം വാക്യൂളുകളും ഘടനാപരമായ രൂപഭേദങ്ങളും ഉണ്ടാക്കി (അനുബന്ധ ചിത്രം. S6). പൈൻ നിമാവിനാശകങ്ങളിൽ രണ്ട് അയോഡോയിൻഡോളുകളും സമാനമായ ഫിനോടൈപ്പിക് സ്വഭാവസവിശേഷതകൾ കാണിച്ചു, അതേസമയം NaI ഉം KI ഉം അങ്ങനെ ചെയ്തില്ല. രസകരമെന്നു പറയട്ടെ, പരിശോധിച്ച സാന്ദ്രതകളിൽ (ഡാറ്റ കാണിച്ചിട്ടില്ല) ഇൻഡോൾ ബി. സൈലോഫിലസിൽ വാക്യൂൾ രൂപീകരണത്തിന് കാരണമായില്ല. അങ്ങനെ, ബി. സൈലോഫിലസിന്റെ വാക്യൂളൈസേഷനും മെറ്റബോളിസത്തിനും ഇൻഡോൾ-അയഡിൻ സമുച്ചയം ഉത്തരവാദിയാണെന്ന് ഫലങ്ങൾ സ്ഥിരീകരിച്ചു.
നിമാവിനാശക പ്രവർത്തനത്തിനായി പരിശോധിച്ച ഇൻഡോളുകളിൽ, 5-അയോഡോഇൻഡോളിന് -5.89 kcal/mol എന്ന ഏറ്റവും ഉയർന്ന സ്ലിപ്പ് സൂചിക ഉണ്ടായിരുന്നു, തുടർന്ന് 7-അയോഡോഇൻഡോൾ (-4.48 kcal/mol), 4-ഫ്ലൂറോഇൻഡോൾ (-4.33), ഇൻഡോൾ (-4.03) (ചിത്രം 6). 5-അയോഡോഇൻഡോളിന്റെ ല്യൂസിൻ 218 ലേക്കുള്ള ശക്തമായ ബാക്ക്ബോൺ ഹൈഡ്രജൻ ബോണ്ടിംഗ് അതിന്റെ ബൈൻഡിംഗിനെ സ്ഥിരപ്പെടുത്തുന്നു, അതേസമയം മറ്റെല്ലാ ഇൻഡോൾ ഡെറിവേറ്റീവുകളും സൈഡ് ചെയിൻ ഹൈഡ്രജൻ ബോണ്ടുകൾ വഴി സെറിൻ 260 മായി ബന്ധിപ്പിക്കുന്നു. മറ്റ് മോഡൽ ചെയ്ത അയോഡൊയിൻഡോളുകളിൽ, 2-അയോഡൊയിൻഡോളിന്റെ ബൈൻഡിംഗ് മൂല്യം -5.248 kcal/mol ആണ്, ഇത് ല്യൂസിൻ 218 യുമായുള്ള പ്രധാന ഹൈഡ്രജൻ ബോണ്ട് മൂലമാണ്. അറിയപ്പെടുന്ന മറ്റ് ബൈൻഡിംഗ് മൂല്യങ്ങളിൽ 3-അയോഡൊയിൻഡോൾ (-4.3 kcal/mol), 4-അയോഡൊയിൻഡോൾ (-4.0 kcal/mol), 6-ഫ്ലൂറോഇൻഡോൾ (-2.6 kcal/mol) എന്നിവ ഉൾപ്പെടുന്നു (അനുബന്ധ ചിത്രം S8). 5-അയോഡൊയിൻഡോൾ, 2-അയോഡൊയിൻഡോൾ എന്നിവ ഒഴികെയുള്ള മിക്ക ഹാലോജനേറ്റഡ് ഇൻഡോളുകളും ഇൻഡോളും സെറിൻ 260 മായി ഒരു ബോണ്ട് ഉണ്ടാക്കുന്നു. ഐവർമെക്റ്റിന് (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം S7) നിരീക്ഷിച്ചതുപോലെ, ലൂസിൻ 218 യുമായുള്ള ഹൈഡ്രജൻ ബോണ്ടിംഗ് കാര്യക്ഷമമായ റിസപ്റ്റർ-ലിഗാൻഡ് ബൈൻഡിംഗിനെ സൂചിപ്പിക്കുന്നു, ഐവർമെക്റ്റിൻ പോലെ 5-അയോഡൊയിൻഡോളും 2-അയോഡൊയിൻഡോളും ലൂസിൻ 218 വഴി ഗ്ലൂസിഎൽ റിസപ്റ്ററിന്റെ സജീവ സൈറ്റുമായി ദൃഡമായി ബന്ധിപ്പിക്കുന്നുവെന്ന് സ്ഥിരീകരിക്കുന്നു (ചിത്രം 6 ഉം സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം S8 ഉം). ഗ്ലൂസിഎൽ സമുച്ചയത്തിന്റെ തുറന്ന പോർ ഘടന നിലനിർത്തുന്നതിനും ഗ്ലൂസിഎൽ റിസപ്റ്ററിന്റെ സജീവ സൈറ്റായ 5-അയോഡൊയിൻഡോൾ, 2-അയോഡൊയിൻഡോൾ, അവെർമെക്റ്റിൻ എന്നിവയുമായി ദൃഡമായി ബന്ധിപ്പിച്ചുകൊണ്ട് അയോൺ ചാനൽ തുറന്ന് നിലനിർത്തുന്നതിനും ദ്രാവക ആഗിരണം അനുവദിക്കുന്നതിനും ഈ ബൈൻഡിംഗ് ആവശ്യമാണെന്ന് ഞങ്ങൾ നിർദ്ദേശിക്കുന്നു.
ഇൻഡോളിന്റെയും ഹാലോജനേറ്റഡ് ഇൻഡോളിന്റെയും മോളിക്യുലാർ ഡോക്കിംഗ് GluCL-ലേക്ക്. (A) ഇൻഡോൾ, (B) 4-ഫ്ലൂറോഇൻഡോൾ, (C) 7-അയോഡോഇൻഡോൾ, (D) 5-അയോഡോഇൻഡോൾ ലിഗാൻഡുകൾ എന്നിവയെ GluCL-ന്റെ സജീവ സൈറ്റിലേക്ക് ബന്ധിപ്പിക്കുന്ന ഓറിയന്റേഷനുകൾ. പ്രോട്ടീനെ ഒരു റിബൺ ഉപയോഗിച്ച് പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നു, കൂടാതെ ബാക്ക്ബോൺ ഹൈഡ്രജൻ ബോണ്ടുകൾ മഞ്ഞ ഡോട്ടഡ് ലൈനുകളായി കാണിച്ചിരിക്കുന്നു. (A′), (B′), (C′), (D′) എന്നിവ ചുറ്റുമുള്ള അമിനോ ആസിഡ് അവശിഷ്ടങ്ങളുമായുള്ള അനുബന്ധ ലിഗാൻഡുകളുടെ പ്രതിപ്രവർത്തനങ്ങൾ കാണിക്കുന്നു, കൂടാതെ സൈഡ്-ചെയിൻ ഹൈഡ്രജൻ ബോണ്ടുകൾ പിങ്ക് ഡോട്ടഡ് അമ്പടയാളങ്ങളാൽ സൂചിപ്പിച്ചിരിക്കുന്നു.
കാബേജ്, മുള്ളങ്കി വിത്തുകൾ മുളയ്ക്കുന്നതിൽ 5-അയോഡോഇൻഡോളിന്റെ വിഷാംശം വിലയിരുത്തുന്നതിനായി പരീക്ഷണങ്ങൾ നടത്തി. 5-അയോഡോഇൻഡോൾ (0.05 അല്ലെങ്കിൽ 0.1 mM) അല്ലെങ്കിൽ അവെർമെക്റ്റിൻ (10 μg/mL) പ്രാരംഭ മുളയ്ക്കലിലും തൈകളുടെ മുളയ്ക്കലിലും കാര്യമായ സ്വാധീനം ചെലുത്തിയില്ല (ചിത്രം 7). കൂടാതെ, ചികിത്സിക്കാത്ത നിയന്ത്രണങ്ങളുടെ മുളയ്ക്കൽ നിരക്കും 5-അയോഡോഇൻഡോൾ അല്ലെങ്കിൽ അവെർമെക്റ്റിൻ ഉപയോഗിച്ച് ചികിത്സിക്കുന്ന വിത്തുകളും തമ്മിൽ കാര്യമായ വ്യത്യാസമൊന്നും കണ്ടെത്തിയില്ല. ടാപ്പ് റൂട്ട് നീളത്തിലും രൂപപ്പെടുന്ന ലാറ്ററൽ വേരുകളുടെ എണ്ണത്തിലും ഉണ്ടായ സ്വാധീനം നിസ്സാരമായിരുന്നു, എന്നിരുന്നാലും 1 mM (അതിന്റെ സജീവ സാന്ദ്രതയുടെ 10 മടങ്ങ്) 5-അയോഡോഇൻഡോൾ ലാറ്ററൽ വേരുകളുടെ വികാസത്തെ ചെറുതായി വൈകിപ്പിച്ചു. ഈ ഫലങ്ങൾ സൂചിപ്പിക്കുന്നത് 5-അയോഡോഇൻഡോൾ സസ്യകോശങ്ങൾക്ക് വിഷരഹിതമാണെന്നും പഠിച്ച സാന്ദ്രതകളിൽ സസ്യ വികസന പ്രക്രിയകളെ തടസ്സപ്പെടുത്തുന്നില്ലെന്നും ആണ്.
വിത്ത് മുളയ്ക്കുന്നതിൽ 5-അയഡോഇൻഡോളിന്റെ സ്വാധീനം. അവെർമെക്റ്റിൻ അല്ലെങ്കിൽ 5-അയഡോഇൻഡോൾ ഉള്ളതോ അല്ലാതെയോ മുറാഷിഗെ, സ്കൂഗ് അഗർ മീഡിയത്തിൽ ബി. ഒലറേസിയ, ആർ. റാഫാനിസ്ട്രം വിത്തുകൾ മുളയ്ക്കൽ, മുളയ്ക്കൽ, പാർശ്വസ്ഥമായ വേരൂന്നൽ എന്നിവ നടത്തുന്നു. 22°C താപനിലയിൽ 3 ദിവസത്തെ ഇൻകുബേഷനുശേഷം മുളയ്ക്കൽ രേഖപ്പെടുത്തി.
ഇൻഡോളുകൾ നിമാവിരകളെ കൊല്ലുന്ന നിരവധി കേസുകൾ ഈ പഠനം റിപ്പോർട്ട് ചെയ്യുന്നു. പ്രധാനമായും, പൈൻ സൂചികളിൽ അയോഡൊയിൻഡോൾ ഇൻഡ്യൂസിംഗ് മെത്തിലേഷൻ (ചെറിയ വാക്യൂളുകൾ ക്രമേണ ഭീമൻ വാക്യൂളുകളായി ലയിക്കുകയും ഒടുവിൽ മെംബ്രൺ വിള്ളലിനും മരണത്തിനും കാരണമാവുകയും ചെയ്യുന്നതിനാൽ ഉണ്ടാകുന്ന ഒരു പ്രക്രിയ) സംബന്ധിച്ച ആദ്യ റിപ്പോർട്ടാണിത്, വാണിജ്യ നെമാറ്റിസൈഡ് അവെർമെക്റ്റിനിന്റേതിന് സമാനമായ ഗണ്യമായ നിമാവിനാശക ഗുണങ്ങൾ അയോഡൊയിൻഡോൾ പ്രകടിപ്പിക്കുന്നു.
പ്രോകാരിയോട്ടുകളിലും യൂക്കാരിയോട്ടുകളിലും ബയോഫിലിം ഇൻഹിബിഷൻ/രൂപീകരണം, ബാക്ടീരിയൽ അതിജീവനം, രോഗകാരിത്വം എന്നിവയുൾപ്പെടെ ഒന്നിലധികം സിഗ്നലിംഗ് പ്രവർത്തനങ്ങൾ ഇൻഡോളുകൾ നടത്തുന്നതായി മുമ്പ് റിപ്പോർട്ട് ചെയ്യപ്പെട്ടിട്ടുണ്ട്. അടുത്തിടെ, ഹാലോജനേറ്റഡ് ഇൻഡോളുകൾ, ഇൻഡോൾ ആൽക്കലോയിഡുകൾ, സെമിസിന്തറ്റിക് ഇൻഡോൾ ഡെറിവേറ്റീവുകൾ എന്നിവയുടെ സാധ്യതയുള്ള ചികിത്സാ ഫലങ്ങൾ വിപുലമായ ഗവേഷണ താൽപ്പര്യം ആകർഷിച്ചു. ഉദാഹരണത്തിന്, ഹാലോജനേറ്റഡ് ഇൻഡോളുകൾ സ്ഥിരമായ എസ്ഷെറിച്ചിയ കോളി, സ്റ്റാഫൈലോകോക്കസ് ഓറിയസ് കോശങ്ങളെ കൊല്ലുന്നതായി കാണിച്ചിട്ടുണ്ട്. കൂടാതെ, മറ്റ് സ്പീഷീസുകൾ, ജനുസുകൾ, രാജ്യങ്ങൾ എന്നിവയ്‌ക്കെതിരെ ഹാലോജനേറ്റഡ് ഇൻഡോളുകളുടെ ഫലപ്രാപ്തി പഠിക്കുന്നത് ശാസ്ത്രീയ താൽപ്പര്യമുള്ളതാണ്, ഈ പഠനം ഈ ലക്ഷ്യം കൈവരിക്കുന്നതിനുള്ള ഒരു ചുവടുവയ്പ്പാണ്.
ഇവിടെ, റിവേഴ്‌സിബിൾ സെൽ ഇൻജുറി (RCI), മെത്തിലേഷൻ (ചിത്രങ്ങൾ 4C, 5) എന്നിവയെ അടിസ്ഥാനമാക്കി സി. എലിഗൻസിലെ 5-അയോഡോഇൻഡോൾ-ഇൻഡ്യൂസ്ഡ് ലെതലിറ്റിക്ക് ഒരു സംവിധാനം ഞങ്ങൾ നിർദ്ദേശിക്കുന്നു (ചിത്രങ്ങൾ 4C, 5). വീർപ്പുമുട്ടൽ, വാക്യുലാർ ഡീജനറേഷൻ തുടങ്ങിയ എഡിമറ്റസ് മാറ്റങ്ങൾ RCI യുടെയും മെത്തിലേഷന്റെയും സൂചകങ്ങളാണ്, സൈറ്റോപ്ലാസത്തിലെ ഭീമൻ വാക്യൂളുകളായി ഇത് പ്രകടമാകുന്നു48,49. ATP ഉത്പാദനം കുറയ്ക്കുന്നതിലൂടെയും, ATPase പമ്പിന്റെ പരാജയത്തിന് കാരണമാകുന്നതിലൂടെയും, അല്ലെങ്കിൽ കോശ സ്തരങ്ങളെ തടസ്സപ്പെടുത്തുന്നതിലൂടെയും, Na+, Ca2+, ജലം എന്നിവയുടെ ദ്രുതഗതിയിലുള്ള ഒഴുക്കിന് കാരണമാകുന്നതിലൂടെയും RCI ഊർജ്ജ ഉൽപാദനത്തെ തടസ്സപ്പെടുത്തുന്നു50,51,52. Ca2+, ജലം53 എന്നിവയുടെ ഒഴുക്ക് കാരണം സൈറ്റോപ്ലാസത്തിൽ ദ്രാവകം അടിഞ്ഞുകൂടുന്നതിന്റെ ഫലമായി മൃഗകോശങ്ങളിൽ ഇൻട്രാസൈറ്റോപ്ലാസ്മിക് വാക്യൂളുകൾ ഉണ്ടാകുന്നു. രസകരമെന്നു പറയട്ടെ, കേടുപാടുകൾ താൽക്കാലികമാണെങ്കിൽ കോശങ്ങൾ ഒരു നിശ്ചിത സമയത്തേക്ക് ATP ഉത്പാദിപ്പിക്കാൻ തുടങ്ങിയാൽ കോശനാശത്തിന്റെ ഈ സംവിധാനം പഴയപടിയാക്കാനാകും, എന്നാൽ കേടുപാടുകൾ തുടരുകയോ വഷളാകുകയോ ചെയ്താൽ കോശങ്ങൾ മരിക്കും. 54 5-അയോഡോഇൻഡോൾ ഉപയോഗിച്ച് ചികിത്സിക്കുന്ന നെമറ്റോഡുകൾക്ക് സമ്മർദ്ദകരമായ സാഹചര്യങ്ങൾക്ക് വിധേയമായതിനുശേഷം സാധാരണ ബയോസിന്തസിസ് പുനഃസ്ഥാപിക്കാൻ കഴിയില്ലെന്ന് ഞങ്ങളുടെ നിരീക്ഷണങ്ങൾ കാണിക്കുന്നു.
ബി. സൈലോഫിലസിലെ 5-അയോഡോഇൻഡോൾ മൂലമുണ്ടാകുന്ന മെത്തിലേഷൻ ഫിനോടൈപ്പ് അയോഡിൻറെ സാന്നിധ്യവും അതിന്റെ തന്മാത്രാ വിതരണവും മൂലമാകാം, കാരണം 7-അയോഡോഇൻഡോളിന് ബി. സൈലോഫിലസിൽ 5-അയോഡോഇൻഡോളിനെ അപേക്ഷിച്ച് കുറഞ്ഞ ഇൻഹിബിറ്ററി പ്രഭാവം മാത്രമേ ഉണ്ടായിരുന്നുള്ളൂ (പട്ടിക 1, സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം S6). മാൾട്ടീസ് തുടങ്ങിയവരുടെ പഠനങ്ങളുമായി ഈ ഫലങ്ങൾ ഭാഗികമായി പൊരുത്തപ്പെടുന്നു. (2014), പാരയിൽ നിന്ന് മെറ്റാ-സ്ഥാനത്തേക്ക് ഇൻഡോളിലെ പിരിഡൈൽ നൈട്രജൻ ഭാഗത്തിന്റെ ട്രാൻസ്‌ലോക്കേഷൻ U251 കോശങ്ങളിലെ വാക്യൂളൈസേഷൻ, വളർച്ചാ തടസ്സം, സൈറ്റോടോക്സിസിറ്റി എന്നിവ ഇല്ലാതാക്കിയെന്ന് അവർ റിപ്പോർട്ട് ചെയ്തു, ഇത് പ്രോട്ടീനിലെ ഒരു പ്രത്യേക സജീവ സൈറ്റുമായുള്ള തന്മാത്രയുടെ പ്രതിപ്രവർത്തനം നിർണായകമാണെന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു27,44,45. ഈ പഠനത്തിൽ നിരീക്ഷിച്ച ഇൻഡോൾ അല്ലെങ്കിൽ ഹാലോജനേറ്റഡ് ഇൻഡോളുകളും ഗ്ലൂസിഎൽ റിസപ്റ്ററുകളും തമ്മിലുള്ള ഇടപെടലുകളും ഈ ആശയത്തെ പിന്തുണയ്ക്കുന്നു, കാരണം 5- ഉം 2-അയോഡോഇൻഡോളും പരിശോധിച്ച മറ്റ് ഇൻഡോളുകളേക്കാൾ കൂടുതൽ ശക്തമായി ഗ്ലൂസിഎൽ റിസപ്റ്ററുകളുമായി ബന്ധിപ്പിക്കുന്നതായി കണ്ടെത്തി (ചിത്രം 6, സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം S8). ഇൻഡോളിന്റെ രണ്ടാമത്തെയോ അഞ്ചാമത്തെയോ സ്ഥാനത്തുള്ള അയോഡിൻ ബാക്ക്ബോൺ ഹൈഡ്രജൻ ബോണ്ടുകൾ വഴി ഗ്ലൂസിഎൽ റിസപ്റ്ററിന്റെ ലൂസിൻ 218 മായി ബന്ധിപ്പിക്കുന്നതായി കണ്ടെത്തി, അതേസമയം മറ്റ് ഹാലോജനേറ്റഡ് ഇൻഡോളുകളും ഇൻഡോളും സെറിൻ 260 യുമായി ദുർബലമായ സൈഡ്-ചെയിൻ ഹൈഡ്രജൻ ബോണ്ടുകൾ ഉണ്ടാക്കുന്നു (ചിത്രം 6). അതിനാൽ, ഹാലോജന്റെ പ്രാദേശികവൽക്കരണം വാക്വോളാർ ഡീജനറേഷന്റെ പ്രേരണയിൽ ഒരു പ്രധാന പങ്ക് വഹിക്കുന്നുണ്ടെന്ന് ഞങ്ങൾ അനുമാനിക്കുന്നു, അതേസമയം 5-അയോഡോയിൻഡോളിന്റെ ഇറുകിയ ബന്ധനം അയോൺ ചാനലിനെ തുറന്നിടുന്നു, അതുവഴി ദ്രുത ദ്രാവക പ്രവാഹവും വാക്വോൾ വിള്ളലും അനുവദിക്കുന്നു. എന്നിരുന്നാലും, 5-അയോഡോയിൻഡോളിന്റെ പ്രവർത്തനത്തിന്റെ വിശദമായ സംവിധാനം നിർണ്ണയിക്കേണ്ടതുണ്ട്.
5-അയോഡൊഇൻഡോൾ പ്രായോഗികമായി പ്രയോഗിക്കുന്നതിന് മുമ്പ്, സസ്യങ്ങളിൽ അതിന്റെ വിഷാംശം വിശകലനം ചെയ്യണം. ഞങ്ങളുടെ വിത്ത് മുളയ്ക്കൽ പരീക്ഷണങ്ങൾ കാണിക്കുന്നത് 5-അയോഡൊഇൻഡോൾ വിത്ത് മുളയ്ക്കുന്നതിനെയോ പഠനവിധേയമാക്കിയ സാന്ദ്രതയിലെ തുടർന്നുള്ള വികസന പ്രക്രിയകളെയോ പ്രതികൂലമായി ബാധിച്ചിട്ടില്ല എന്നാണ് (ചിത്രം 7). അതിനാൽ, പൈൻ നിമാവിരകൾ പൈൻ മരങ്ങൾക്ക് ഉണ്ടാക്കുന്ന ദോഷം നിയന്ത്രിക്കുന്നതിന് പാരിസ്ഥിതിക പരിതസ്ഥിതിയിൽ 5-അയോഡൊഇൻഡോൾ ഉപയോഗിക്കുന്നതിനുള്ള അടിസ്ഥാനം ഈ പഠനം നൽകുന്നു.
ആൻറിബയോട്ടിക് പ്രതിരോധത്തിന്റെയും കാൻസർ പുരോഗതിയുടെയും പ്രശ്നം പരിഹരിക്കുന്നതിനുള്ള ഒരു സാധ്യതയുള്ള സമീപനമാണ് ഇൻഡോൾ അധിഷ്ഠിത തെറാപ്പി പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നതെന്ന് മുൻ റിപ്പോർട്ടുകൾ തെളിയിച്ചിട്ടുണ്ട്55. കൂടാതെ, ഇൻഡോളുകൾക്ക് ആൻറി ബാക്ടീരിയൽ, കാൻസർ വിരുദ്ധ, ആന്റിഓക്‌സിഡന്റ്, ആന്റി-ഇൻഫ്ലമേറ്ററി, പ്രമേഹ വിരുദ്ധ, ആൻറിവൈറൽ, ആന്റിപ്രൊലിഫറേറ്റീവ്, ക്ഷയരോഗ വിരുദ്ധ പ്രവർത്തനങ്ങൾ ഉണ്ട്, കൂടാതെ മരുന്നുകളുടെ വികസനത്തിന് ഒരു വാഗ്ദാനമായ അടിത്തറയായി ഇത് പ്രവർത്തിച്ചേക്കാം56,57. ഒരു ആന്റിപാരാസിറ്റിക്, ആന്തെൽമിന്റിക് ഏജന്റായി അയോഡിൻ ഉപയോഗിക്കാനുള്ള സാധ്യത ആദ്യമായി ഈ പഠനം സൂചിപ്പിക്കുന്നു.
മൂന്ന് പതിറ്റാണ്ടുകൾക്ക് മുമ്പ് അവെർമെക്റ്റിൻ കണ്ടെത്തുകയും 2015 ൽ നോബൽ സമ്മാനം നേടുകയും ചെയ്തു, ഒരു ആന്തെൽമിന്റിക് ആയി അതിന്റെ ഉപയോഗം ഇപ്പോഴും സജീവമായി തുടരുന്നു. എന്നിരുന്നാലും, നിമാവിരകളിലും കീടങ്ങളിലും അവെർമെക്റ്റിനുകൾക്കെതിരായ പ്രതിരോധം വേഗത്തിൽ വികസിക്കുന്നതിനാൽ, പൈൻ മരങ്ങളിലെ PWN അണുബാധ നിയന്ത്രിക്കുന്നതിന് ഒരു ബദൽ, കുറഞ്ഞ ചെലവുള്ളതും പരിസ്ഥിതി സൗഹൃദപരവുമായ തന്ത്രം ആവശ്യമാണ്. 5-അയോഡൊയിൻഡോൾ പൈൻ നിമാവിരകളെ കൊല്ലുന്ന സംവിധാനത്തെക്കുറിച്ചും 5-അയോഡൊയിൻഡോളിന് സസ്യകോശങ്ങൾക്ക് കുറഞ്ഞ വിഷാംശം ഉണ്ടെന്നും ഈ പഠനം റിപ്പോർട്ട് ചെയ്യുന്നു, ഇത് ഭാവിയിലെ വാണിജ്യ പ്രയോഗത്തിന് നല്ല സാധ്യതകൾ തുറക്കുന്നു.
എല്ലാ പരീക്ഷണങ്ങളും കൊറിയയിലെ ജിയോങ്‌സാനിലുള്ള യെങ്‌നാം സർവകലാശാലയിലെ എത്തിക്‌സ് കമ്മിറ്റി അംഗീകരിച്ചു, കൂടാതെ യെങ്‌നാം സർവകലാശാലയിലെ എത്തിക്‌സ് കമ്മിറ്റിയുടെ മാർഗ്ഗനിർദ്ദേശങ്ങൾക്കനുസൃതമായാണ് രീതികൾ നടപ്പിലാക്കിയത്.
സ്ഥാപിത നടപടിക്രമങ്ങൾ ഉപയോഗിച്ചാണ് മുട്ട ഇൻകുബേഷൻ പരീക്ഷണങ്ങൾ നടത്തിയത്. വിരിയുന്ന നിരക്ക് (HR) വിലയിരുത്തുന്നതിന്, ഒരു ദിവസം പ്രായമുള്ള മുതിർന്ന നിമറ്റോഡുകളെ (ഏകദേശം 100 പെൺ നിമറ്റോഡുകളും 100 ആൺ നിമറ്റോഡുകളും) ഫംഗസ് അടങ്ങിയ പെട്രി ഡിഷുകളിലേക്ക് മാറ്റി 24 മണിക്കൂർ വളരാൻ അനുവദിച്ചു. പിന്നീട് മുട്ടകളെ വേർതിരിച്ച് 5-അയോഡോയിൻഡോൾ (0.05 mM ഉം 0.1 mM ഉം) അല്ലെങ്കിൽ അവെർമെക്റ്റിൻ (10 μg/ml) ഉപയോഗിച്ച് അണുവിമുക്തമായ വാറ്റിയെടുത്ത വെള്ളത്തിൽ ഒരു സസ്പെൻഷനായി സംസ്കരിച്ചു. ഈ സസ്പെൻഷനുകൾ (500 μl; ഏകദേശം 100 മുട്ടകൾ) 24 കിണർ ടിഷ്യു കൾച്ചർ പ്ലേറ്റിന്റെ കിണറുകളിലേക്ക് മാറ്റി 22 °C ൽ ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്തു. 24 മണിക്കൂർ ഇൻകുബേഷനുശേഷം L2 എണ്ണം നടത്തി, പക്ഷേ നേർത്ത പ്ലാറ്റിനം വയർ ഉപയോഗിച്ച് ഉത്തേജിപ്പിക്കുമ്പോൾ കോശങ്ങൾ നീങ്ങിയില്ലെങ്കിൽ അവ മരിച്ചതായി കണക്കാക്കി. ഈ പരീക്ഷണം രണ്ട് ഘട്ടങ്ങളിലായാണ് നടത്തിയത്, ഓരോന്നിനും ആറ് ആവർത്തനങ്ങൾ. രണ്ട് പരീക്ഷണങ്ങളിൽ നിന്നുമുള്ള ഡാറ്റ സംയോജിപ്പിച്ച് അവതരിപ്പിച്ചു. HR ന്റെ ശതമാനം ഇനിപ്പറയുന്ന രീതിയിൽ കണക്കാക്കുന്നു:
മുമ്പ് വികസിപ്പിച്ചെടുത്ത നടപടിക്രമങ്ങൾ ഉപയോഗിച്ചാണ് ലാർവ മരണനിരക്ക് വിലയിരുത്തിയത്. നെമറ്റോഡ് മുട്ടകൾ ശേഖരിച്ച്, അണുവിമുക്തമാക്കിയ വാറ്റിയെടുത്ത വെള്ളത്തിൽ വിരിഞ്ഞ് ഭ്രൂണങ്ങളെ സമന്വയിപ്പിച്ച് L2 ഘട്ട ലാർവകളെ സൃഷ്ടിച്ചു. സിൻക്രൊണൈസ് ചെയ്ത ലാർവകളെ (ഏകദേശം 500 നെമറ്റോഡുകൾ) 5-അയോഡോഇൻഡോൾ (0.05 mM ഉം 0.1 mM ഉം) അല്ലെങ്കിൽ അവെർമെക്റ്റിൻ (10 μg/ml) ഉപയോഗിച്ച് ചികിത്സിക്കുകയും B. സിനെറിയ പെട്രി പ്ലേറ്റുകളിൽ വളർത്തുകയും ചെയ്തു. 22 °C താപനിലയിൽ 48 മണിക്കൂർ ഇൻകുബേഷനുശേഷം, നെമറ്റോഡുകൾ അണുവിമുക്തമാക്കിയ വാറ്റിയെടുത്ത വെള്ളത്തിൽ ശേഖരിച്ച് L2, L3, L4 ഘട്ടങ്ങളുടെ സാന്നിധ്യത്തിനായി പരിശോധിച്ചു. L3, L4 ഘട്ടങ്ങളുടെ സാന്നിധ്യം ലാർവ പരിവർത്തനത്തെ സൂചിപ്പിക്കുന്നു, അതേസമയം L2 ഘട്ടത്തിന്റെ സാന്നിധ്യം പരിവർത്തനമില്ലെന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു. iRiS™ ഡിജിറ്റൽ സെൽ ഇമേജിംഗ് സിസ്റ്റം ഉപയോഗിച്ച് ചിത്രങ്ങൾ നേടി. ഈ പരീക്ഷണം രണ്ട് ഘട്ടങ്ങളിലായാണ് നടത്തിയത്, ഓരോന്നിനും ആറ് ആവർത്തനങ്ങൾ വീതമുണ്ട്. രണ്ട് പരീക്ഷണങ്ങളിൽ നിന്നുമുള്ള ഡാറ്റ സംയോജിപ്പിച്ച് അവതരിപ്പിച്ചു.
മുറാഷിഗെ, സ്കൂഗ് അഗർ പ്ലേറ്റുകളിലെ മുളയ്ക്കൽ പരിശോധനകൾ ഉപയോഗിച്ചാണ് 5-അയഡോഇൻഡോളിന്റെയും അവെർമെക്റ്റിന്റെയും വിഷാംശം വിത്തുകളിൽ വിലയിരുത്തിയത്. 62 ബി. ഒലറേസിയ, ആർ. റാഫാനിസ്ട്രം വിത്തുകൾ ആദ്യം അണുവിമുക്തമാക്കിയ വാറ്റിയെടുത്ത വെള്ളത്തിൽ ഒരു ദിവസം മുക്കിവയ്ക്കുക, 1 മില്ലി 100% എത്തനോൾ ഉപയോഗിച്ച് കഴുകുക, 1 മില്ലി 50% കൊമേഴ്‌സ്യൽ ബ്ലീച്ച് (3% സോഡിയം ഹൈപ്പോക്ലോറൈറ്റ്) ഉപയോഗിച്ച് 15 മിനിറ്റ് അണുവിമുക്തമാക്കുക, 1 മില്ലി അണുവിമുക്തമാക്കിയ വെള്ളം ഉപയോഗിച്ച് അഞ്ച് തവണ കഴുകുക. അണുവിമുക്തമാക്കിയ വിത്തുകൾ 0.86 ഗ്രാം/ലി (0.2X) മുറാഷിഗെ, സ്കൂഗ് മീഡിയം, 0.7% ബാക്ടീരിയോളജിക്കൽ അഗർ എന്നിവ അടങ്ങിയ മുളയ്ക്കൽ അഗെർ പ്ലേറ്റുകളിൽ 5-അയഡോഇൻഡോൾ അല്ലെങ്കിൽ അവെർമെക്റ്റിൻ ഉപയോഗിച്ചോ അല്ലാതെയോ അമർത്തി. തുടർന്ന് പ്ലേറ്റുകൾ 22 °C യിൽ ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്യുകയും 3 ദിവസത്തെ ഇൻകുബേഷനുശേഷം ചിത്രങ്ങൾ എടുക്കുകയും ചെയ്തു. ഈ പരീക്ഷണം രണ്ട് ഘട്ടങ്ങളിലായാണ് നടത്തിയത്, ഓരോന്നിനും ആറ് ആവർത്തനങ്ങളുണ്ടായിരുന്നു.