MAMP-എലിസിറ്റഡ് ഡിഫൻസ് റെസ്‌പോൺസിൻ്റെ ശക്തിയുടെയും സോർഗത്തിലെ ഇലപ്പുള്ളിയുടെ ടാർഗെറ്റിനുള്ള പ്രതിരോധത്തിൻ്റെയും ജീനോം-വൈഡ് അസോസിയേഷൻ വിശകലനം

സസ്യങ്ങളും രോഗകാരി വസ്തുക്കളും

സോർഗം കൺവേർഷൻ പോപ്പുലേഷൻ (എസ്‌സിപി) എന്നറിയപ്പെടുന്ന ഒരു സോർഗം അസോസിയേഷൻ മാപ്പിംഗ് പോപ്പുലേഷൻ നൽകിയത് ഇല്ലിനോയി യൂണിവേഴ്‌സിറ്റിയിലെ (ഇപ്പോൾ യുസി ഡേവിസിൽ) ഡോ. പാറ്റ് ബ്രൗൺ.യുഎസ് പരിതസ്ഥിതികളിലെ സസ്യങ്ങളുടെ വളർച്ചയും വികാസവും സുഗമമാക്കുന്നതിന് ഫോട്ടോപെരിയോഡ്-ഇൻസെൻസിറ്റിവിറ്റിയിലേക്കും ചെറിയ ഉയരത്തിലേക്കും പരിവർത്തനം ചെയ്ത വൈവിധ്യമാർന്ന ലൈനുകളുടെ ഒരു ശേഖരമാണിത്.ഈ പോപ്പുലേഷനിൽ നിന്നുള്ള 510 വരികൾ ഈ പഠനത്തിൽ ഉപയോഗിച്ചിരുന്നുവെങ്കിലും മോശം മുളയ്ക്കലും മറ്റ് ഗുണനിലവാര നിയന്ത്രണ പ്രശ്‌നങ്ങളും കാരണം, മൂന്ന് സ്വഭാവസവിശേഷതകളുടെയും വിശകലനത്തിൽ എല്ലാ വരികളും ഉപയോഗിച്ചിട്ടില്ല.ആത്യന്തികമായി, ചിറ്റിൻ പ്രതികരണത്തിൻ്റെ വിശകലനത്തിനായി 345 ലൈനുകളിൽ നിന്നുള്ള ഡാറ്റയും flg22 പ്രതികരണത്തിന് 472 ലൈനുകളും TLS പ്രതിരോധത്തിനായി 456 വരികളും ഉപയോഗിച്ചു.ബി. കുക്കിസ്ട്രെയിൻ LSLP18 അർക്കൻസാസ് സർവകലാശാലയിലെ ഡോ. ബർട്ട് ബ്ലൂമിൽ നിന്നാണ് ലഭിച്ചത്.

MAMP പ്രതികരണ അളവ്

ഈ പഠനത്തിൽ രണ്ട് വ്യത്യസ്ത MAMP-കൾ ഉപയോഗിച്ചു flg22, (ജെൻസ്‌ക്രിപ്റ്റ് കാറ്റലോഗ്# RP19986), ചിറ്റിൻ .ഗ്രീൻഹൗസിൽ മണ്ണ് നിറച്ച ഫ്ലാറ്റുകളിൽ (33% സൺഷൈൻ റെഡി-എർത്ത് പ്രോ ഗ്രോയിംഗ് മിക്‌സ്) ഇട്ട ഇൻസെർട്ടുകളിലാണ് സോർഗം ചെടികൾ വളർത്തിയത്.ശേഖരിക്കുന്ന ദിവസം അധിക ഇല ഈർപ്പം ഒഴിവാക്കാൻ സാമ്പിൾ ശേഖരണത്തിൻ്റെ തലേദിവസം ചെടികൾ നനച്ചു.

ലൈനുകൾ ക്രമരഹിതമാക്കി, ലോജിസ്റ്റിക് കാരണങ്ങളാൽ, 60 വരികളുടെ ബാച്ചുകളായി നട്ടുപിടിപ്പിച്ചു.ഓരോ ലൈനിനും രണ്ട് വിത്ത് വീതം മൂന്ന് 'ചട്ടി' നട്ടു.മുഴുവൻ ജനസംഖ്യയും വിലയിരുത്തുന്നത് വരെ മുൻ ബാച്ച് പ്രോസസ്സ് ചെയ്ത ഉടൻ തന്നെ തുടർന്നുള്ള ബാച്ചുകൾ നട്ടുപിടിപ്പിച്ചു.രണ്ട് റണ്ണുകളിലും ജനിതകരൂപങ്ങൾ പുനഃക്രമീകരിച്ച് രണ്ട് MAMP-കൾക്കായി രണ്ട് പരീക്ഷണാത്മക റണ്ണുകൾ നടത്തി.

മുമ്പ് വിവരിച്ചതുപോലെ ROS പരിശോധനകൾ നടത്തി.ചുരുക്കത്തിൽ, ഓരോ വരിയിലും, 3 വ്യത്യസ്ത കലങ്ങളിൽ ആറ് വിത്തുകൾ നട്ടുപിടിപ്പിച്ചു.തത്ഫലമായുണ്ടാകുന്ന തൈകളിൽ നിന്ന്, ഏകീകൃതതയുടെ അടിസ്ഥാനത്തിൽ മൂന്നെണ്ണം തിരഞ്ഞെടുത്തു.അസാധാരണമായി തോന്നുന്നതോ ഭൂരിപക്ഷത്തേക്കാൾ ഉയരമോ ചെറുതോ ആയ തൈകൾ ഉപയോഗിച്ചിട്ടില്ല.15 ദിവസം പ്രായമായ മൂന്ന് വ്യത്യസ്ത സോർഗം ചെടികളുടെ നാലാമത്തെ ഇലയുടെ വിശാലമായ ഭാഗത്ത് നിന്ന് 3 മില്ലീമീറ്റർ വ്യാസമുള്ള നാല് ഇല ഡിസ്‌കുകൾ വെട്ടിമാറ്റി.രണ്ട് ചെടികളിൽ നിന്ന് ഒരു ഇലയ്ക്ക് ഒരു ഡിസ്കും ഒരു ചെടിയിൽ നിന്ന് രണ്ട് ഡിസ്കുകളും, രണ്ടാമത്തെ ഡിസ്ക് ജല നിയന്ത്രണമായി മാറുന്നു (താഴെ കാണുക).ഒരു കറുത്ത 96 കിണർ പ്ലേറ്റിൽ 50 µl H20-ൽ ഡിസ്കുകൾ വ്യക്തിഗതമായി ഫ്ലോട്ട് ചെയ്തു, പ്രകാശം എക്സ്പോഷർ ചെയ്യാതിരിക്കാൻ ഒരു അലുമിനിയം സീൽ ഉപയോഗിച്ച് അടച്ചു, രാത്രി മുഴുവൻ ഊഷ്മാവിൽ സൂക്ഷിച്ചു.പിറ്റേന്ന് രാവിലെ 2 mg/ml കെമിലുമിനസെൻ്റ് പ്രോബ് L-012 (വാക്കോ, കാറ്റലോഗ് # 120-04891), 2 mg/ml നിറകണ്ണുകളോടെ പെറോക്‌സിഡേസ് (ടൈപ്പ് VI-A, സിഗ്മ-ആൽഡ്രിച്ച്, കാറ്റലോഗ് # P6782) ഉപയോഗിച്ച് ഒരു പ്രതികരണ പരിഹാരം ഉണ്ടാക്കി. 100 mg/ml Chitin അല്ലെങ്കിൽ 2 μM Flg22.ഈ പ്രതികരണ ലായനിയുടെ 50 μl നാല് കിണറുകളിൽ മൂന്നെണ്ണത്തിൽ ചേർത്തു.നാലാമത്തെ കിണർ ഒരു മോക്ക് കൺട്രോൾ ആയിരുന്നു, അതിൽ MAMP ഒഴികെയുള്ള പ്രതികരണ പരിഹാരം ചേർത്തു.ഓരോ പ്ലേറ്റിലും വെള്ളം മാത്രമുള്ള നാല് ഒഴിഞ്ഞ കിണറുകളും ഉൾപ്പെടുത്തിയിട്ടുണ്ട്.

പ്രതികരണ പരിഹാരം ചേർത്തതിന് ശേഷം, 1 മണിക്കൂർ ഓരോ 2 മിനിറ്റിലും സിനർജി TM 2 മൾട്ടി-ഡിറ്റക്ഷൻ മൈക്രോപ്ലേറ്റ് റീഡർ (ബയോടെക്) ഉപയോഗിച്ച് പ്രകാശം അളക്കുന്നു.ഈ 1 മണിക്കൂറിൽ ഓരോ 2 മിനിറ്റിലും പ്ലേറ്റ് റീഡർ പ്രകാശമാനത അളക്കുന്നു.ഓരോ കിണറിൻ്റെയും മൂല്യം നൽകുന്നതിന് എല്ലാ 31 റീഡിംഗുകളുടെയും ആകെത്തുക കണക്കാക്കി.ഓരോ ജനിതകരൂപത്തിനുമുള്ള MAMP പ്രതികരണത്തിനായുള്ള കണക്കാക്കിയ മൂല്യം കണക്കാക്കിയിരിക്കുന്നത് (മൂന്ന് പരീക്ഷണാത്മക കിണറുകളുടെ ശരാശരി ലുമിനസെൻസ് മൂല്യം-മോക്ക് വെൽ മൂല്യം) - ശരാശരി ശൂന്യമായ കിണറിൻ്റെ മൂല്യം മൈനസ്.ശൂന്യമായ കിണറിൻ്റെ മൂല്യങ്ങൾ സ്ഥിരമായി പൂജ്യത്തിനടുത്തായിരുന്നു.

ഇല ഡിസ്കുകൾനിക്കോട്ടിയാന ബെന്താമിയാന, ഉയർന്ന പ്രതികരണശേഷിയുള്ള ഒരു സോർഗം ലൈൻ (SC0003), ഒരു ലോ റെസ്‌പോൺസീവ് സോർഗം ലൈൻ (PI 6069) എന്നിവയും ഗുണനിലവാര നിയന്ത്രണ ആവശ്യങ്ങൾക്കായി ഓരോ 96-കിണർ പ്ലേറ്റിലും നിയന്ത്രണങ്ങളായി ഉൾപ്പെടുത്തിയിട്ടുണ്ട്.

ബി. കുക്കിഇനോക്കുലം തയ്യാറാക്കലും കുത്തിവയ്പ്പും

ബി. കുക്കിമുമ്പ് വിവരിച്ചതുപോലെ ഇനോക്കുലം തയ്യാറാക്കിയിട്ടുണ്ട്.ചുരുക്കത്തിൽ, സോർഗം ധാന്യങ്ങൾ മൂന്ന് ദിവസം വെള്ളത്തിൽ കുതിർത്ത്, കഴുകി, 1 ലിറ്റർ കോണാകൃതിയിലുള്ള ഫ്ലാസ്കുകളാക്കി 15psi, 121 °C താപനിലയിൽ ഒരു മണിക്കൂർ ഓട്ടോക്ലേവ് ചെയ്തു.ധാന്യങ്ങളിൽ ഒരു പുത്തൻ സംസ്‌കാരത്തിൽ നിന്ന് ഏകദേശം 5 മില്ലി മെസെറേറ്റഡ് മൈസീലിയ കുത്തിവയ്ക്കപ്പെട്ടുബി. കുക്കിLSLP18 ഒറ്റപ്പെട്ട് 2 ആഴ്ച ഊഷ്മാവിൽ അവശേഷിക്കുന്നു, ഓരോ 3 ദിവസത്തിലും ഫ്ലാസ്കുകൾ കുലുക്കുന്നു.2 ആഴ്‌ചയ്‌ക്ക് ശേഷം, കുമിൾ ബാധിച്ച ചേനയുടെ ധാന്യങ്ങൾ വായുവിൽ ഉണക്കി 4 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ ഫീൽഡ് ഇൻകുലേഷൻ വരെ സൂക്ഷിക്കുന്നു.മുഴുവൻ ട്രയലിനും ഒരേ ഇനോക്കുലം ഉപയോഗിക്കുകയും എല്ലാ വർഷവും പുതുതായി ഉണ്ടാക്കുകയും ചെയ്തു.കുത്തിവയ്പ്പിനായി, 4-5 ആഴ്‌ച പ്രായമായ ചേന ചെടികളുടെ ചുഴിയിൽ 6-10 രോഗബാധയുള്ള ധാന്യങ്ങൾ ഇട്ടു.ഈ കുമിളുകളിൽ നിന്ന് ഉത്പാദിപ്പിക്കുന്ന ബീജങ്ങൾ ഒരാഴ്ചയ്ക്കുള്ളിൽ ഇളം ചെടികളിൽ അണുബാധയുണ്ടാക്കി.

വിത്ത് തയ്യാറാക്കൽ

കൃഷിയിടത്തിൽ സോർഗം വിത്ത് നടുന്നതിന് മുമ്പ് ഒരു കുമിൾനാശിനി, കീടനാശിനി, ~ 1% സ്പിരാറ്റോ 480 എഫ്എസ് കുമിൾനാശിനി, 4% സെബ്രിംഗ് 480 എഫ്എസ് കുമിൾനാശിനി, 3% സോർപ്രോ 940 ES സീഡ് സേഫ്നർ എന്നിവ അടങ്ങിയ സേഫ്നർ മിശ്രിതം ഉപയോഗിച്ച് ചികിത്സിച്ചു.പിന്നീട് വിത്തുകൾ 3 ദിവസം വായുവിൽ ഉണക്കി, വിത്തുകൾക്ക് ചുറ്റും ഈ മിശ്രിതം നേർത്ത പൂശുന്നു.ഡ്യുവൽ മാഗ്നം എന്ന കളനാശിനിയുടെ ഉപയോഗം സേഫ്നർ അനുവദിച്ചു.

ടാർഗെറ്റ് ലീഫ് സ്പോട്ട് പ്രതിരോധത്തിൻ്റെ വിലയിരുത്തൽ

ഓരോ കേസിലും രണ്ട് പരീക്ഷണാത്മക പകർപ്പുകളുള്ള ക്രമരഹിതമായ സമ്പൂർണ്ണ ബ്ലോക്ക് രൂപകൽപ്പനയിൽ 2017 ജൂൺ 14-15 നും ജൂൺ 20, 2018 നും NCയിലെ ക്ലേട്ടണിലെ സെൻട്രൽ ക്രോപ്‌സ് റിസർച്ച് സ്റ്റേഷനിൽ SCP നട്ടുപിടിപ്പിച്ചു.ഓരോ പ്ലോട്ടിനും 10 വിത്തുകൾ വീതം 0.9 മീറ്റർ വരി വീതിയിൽ 1.8 മീറ്റർ ഒറ്റവരിയിലാണ് പരീക്ഷണങ്ങൾ നട്ടത്.എഡ്ജ് ഇഫക്റ്റുകൾ തടയാൻ ഓരോ പരീക്ഷണത്തിൻ്റെയും ചുറ്റളവിൽ രണ്ട് ബോർഡർ വരികൾ നട്ടുപിടിപ്പിച്ചു.2017 ജൂലൈ 20 നും 2018 ജൂലൈ 20 നും പരീക്ഷണങ്ങൾ കുത്തിവയ്‌പിച്ചു, ആ ഘട്ടത്തിൽ സോർഗം ചെടികൾ വളർച്ചയുടെ ഘട്ടം 3 ആയിരുന്നു. ഒന്ന് മുതൽ ഒമ്പത് സ്കെയിലുകളിൽ റേറ്റിംഗുകൾ എടുത്തിട്ടുണ്ട്, അവിടെ രോഗലക്ഷണങ്ങളൊന്നും കാണിക്കാത്ത ചെടികൾ ഒമ്പത് ആയി സ്കോർ ചെയ്തു. ചത്ത ചെടികൾ ഒന്നായി സ്കോർ ചെയ്തു.2017-ൽ രണ്ട് റേറ്റിംഗുകളും 2018-ൽ നാല് റീഡിംഗുകളും ഓരോ വർഷവും കുത്തിവയ്പ്പ് കഴിഞ്ഞ് രണ്ടാഴ്ച കഴിഞ്ഞ് ആരംഭിക്കുന്നു.sAUDPC (രോഗ പുരോഗതി വക്രത്തിന് കീഴിലുള്ള സ്റ്റാൻഡേർഡ് ഏരിയ) മുമ്പ് വിവരിച്ചതുപോലെ കണക്കാക്കി.