ഷൂട്ട് അപിക്കൽ മെറിസ്റ്റമിലെ ഇന്റർനോഡ് സ്പെസിഫിക്കേഷനിൽ ഗിബ്ബെറെല്ലിനുകളുടെ പങ്ക് ക്വാണ്ടിറ്റേറ്റീവ് ഗിബ്ബെറെലിൻ ബയോസെൻസർ വെളിപ്പെടുത്തുന്നു.

തണ്ടിന്റെ ഘടനയ്ക്ക് ഷൂട്ട് അപിക്കൽ മെറിസ്റ്റം (SAM) വളർച്ച നിർണായകമാണ്. സസ്യ ഹോർമോണുകൾഗിബ്ബെരെല്ലിൻസ്(GAs) സസ്യവളർച്ച ഏകോപിപ്പിക്കുന്നതിൽ പ്രധാന പങ്ക് വഹിക്കുന്നു, പക്ഷേ SAM-ൽ അവയുടെ പങ്ക് ഇപ്പോഴും മോശമായി മനസ്സിലാക്കപ്പെട്ടിരിക്കുന്നു. ഇവിടെ, GA ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷണൽ പ്രതികരണത്തിൽ അതിന്റെ അവശ്യ നിയന്ത്രണ പ്രവർത്തനത്തെ അടിച്ചമർത്തുന്നതിനും GA തിരിച്ചറിയലിൽ അതിന്റെ ഡീഗ്രേഡേഷൻ സംരക്ഷിക്കുന്നതിനുമായി DELLA പ്രോട്ടീൻ എഞ്ചിനീയറിംഗ് ചെയ്തുകൊണ്ട് GA സിഗ്നലിംഗിന്റെ ഒരു റേഷ്യോമെട്രിക് ബയോസെൻസർ ഞങ്ങൾ വികസിപ്പിച്ചെടുത്തു. ഈ ഡീഗ്രേഡേഷൻ അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള ബയോസെൻസർ വികസന സമയത്ത് GA ലെവലുകളിലും സെല്ലുലാർ സെൻസിംഗിലുമുള്ള മാറ്റങ്ങൾ കൃത്യമായി രേഖപ്പെടുത്തുന്നുവെന്ന് ഞങ്ങൾ തെളിയിക്കുന്നു. SAM-ൽ GA സിഗ്നലിംഗ് പ്രവർത്തനം മാപ്പ് ചെയ്യാൻ ഞങ്ങൾ ഈ ബയോസെൻസർ ഉപയോഗിച്ചു. ഇന്റർനോഡ് കോശങ്ങളുടെ മുൻഗാമികളായ ഓർഗൻ പ്രൈമോർഡിയകൾക്കിടയിൽ സ്ഥിതിചെയ്യുന്ന കോശങ്ങളിലാണ് ഉയർന്ന GA സിഗ്നലുകൾ പ്രധാനമായും കാണപ്പെടുന്നതെന്ന് ഞങ്ങൾ കാണിക്കുന്നു. പ്രവർത്തന നേട്ടവും നഷ്ടവും സംബന്ധിച്ച സമീപനങ്ങൾ ഉപയോഗിച്ച്, GA സെൽ ഡിവിഷൻ തലത്തിന്റെ ഓറിയന്റേഷൻ നിയന്ത്രിക്കുന്നുവെന്നും, ഇന്റർനോഡുകളുടെ കാനോനിക്കൽ സെല്ലുലാർ ഓർഗനൈസേഷൻ സ്ഥാപിക്കുന്നുവെന്നും, അതുവഴി SAM-ൽ ഇന്റർനോഡ് സ്പെസിഫിക്കേഷൻ പ്രോത്സാഹിപ്പിക്കുന്നുവെന്നും ഞങ്ങൾ കൂടുതൽ തെളിയിക്കുന്നു.
ചിനപ്പുപൊട്ടലിന്റെ അഗ്രത്തിൽ സ്ഥിതി ചെയ്യുന്ന ഷൂട്ട് അപിക്കൽ മെറിസ്റ്റത്തിൽ (SAM) ഒരു പ്രത്യേക സ്റ്റെം സെല്ലുകൾ അടങ്ങിയിരിക്കുന്നു, ഇവയുടെ പ്രവർത്തനം സസ്യജീവിതത്തിലുടനീളം മോഡുലാർ, ഇറ്ററേറ്റീവ് രീതിയിൽ ലാറ്ററൽ അവയവങ്ങളും സ്റ്റെം നോഡുകളും സൃഷ്ടിക്കുന്നു. ഈ ആവർത്തിച്ചുള്ള യൂണിറ്റുകളിൽ അല്ലെങ്കിൽ സസ്യ നോഡുകളിൽ നോഡുകളിലെ ഇന്റർനോഡുകളും ലാറ്ററൽ അവയവങ്ങളും ഇല കക്ഷങ്ങളിലെ ആക്സിലറി മെറിസ്റ്റമുകളും ഉൾപ്പെടുന്നു. വികസന സമയത്ത് സസ്യ നോഡുകളുടെ വളർച്ചയും ഓർഗനൈസേഷനും മാറുന്നു. അറബിഡോപ്സിസിൽ, സസ്യ ഘട്ടത്തിൽ ഇന്റർനോഡൽ വളർച്ച അടിച്ചമർത്തപ്പെടുന്നു, കൂടാതെ റോസറ്റ് ഇലകളുടെ കക്ഷങ്ങളിൽ ആക്സിലറി മെറിസ്റ്റമുകൾ നിദ്രയിലാണ്ടിരിക്കും. പുഷ്പ ഘട്ടത്തിലേക്കുള്ള പരിവർത്തന സമയത്ത്, SAM പൂങ്കുല മെറിസ്റ്റമായി മാറുന്നു, നീളമേറിയ ഇന്റർനോഡുകളും കക്ഷീയ മുകുളങ്ങളും, കോലൈൻ ഇലകളുടെ കക്ഷങ്ങളിൽ ശാഖകളും, പിന്നീട് ഇലയില്ലാത്ത പൂക്കളും 2 സൃഷ്ടിക്കുന്നു. ഇലകൾ, പൂക്കൾ, ശാഖകൾ എന്നിവയുടെ ആരംഭം നിയന്ത്രിക്കുന്ന സംവിധാനങ്ങൾ മനസ്സിലാക്കുന്നതിൽ നമ്മൾ ഗണ്യമായ പുരോഗതി കൈവരിച്ചിട്ടുണ്ടെങ്കിലും, ഇന്റർനോഡുകൾ എങ്ങനെ ഉണ്ടാകുന്നു എന്നതിനെക്കുറിച്ച് താരതമ്യേന വളരെക്കുറച്ചേ അറിയൂ.
GA-കളുടെ സ്പേഷ്യോടെമ്പറൽ ഡിസ്ട്രിബ്യൂഷൻ മനസ്സിലാക്കുന്നത് വ്യത്യസ്ത കലകളിലും വ്യത്യസ്ത വികസന ഘട്ടങ്ങളിലും ഈ ഹോർമോണുകളുടെ പ്രവർത്തനങ്ങൾ നന്നായി മനസ്സിലാക്കാൻ സഹായിക്കും. സ്വന്തം പ്രൊമോട്ടറുടെ പ്രവർത്തനത്തിൽ പ്രകടിപ്പിക്കുന്ന RGA-GFP സംയോജനത്തിന്റെ ഡീഗ്രഡേഷൻ ദൃശ്യവൽക്കരിക്കുന്നത് വേരുകളിലെ മൊത്തം GA ലെവലുകളുടെ നിയന്ത്രണത്തെക്കുറിച്ചുള്ള പ്രധാന വിവരങ്ങൾ നൽകുന്നു15,16. എന്നിരുന്നാലും, RGA എക്സ്പ്രഷൻ ടിഷ്യൂകളിൽ വ്യത്യാസപ്പെടുന്നു17 കൂടാതെ GA18 നിയന്ത്രിക്കുന്നു. അതിനാൽ, RGA പ്രൊമോട്ടറുടെ ഡിഫറൻഷ്യൽ എക്സ്പ്രഷൻ RGA-GFP-യിൽ നിരീക്ഷിക്കപ്പെടുന്ന ഫ്ലൂറസെൻസ് പാറ്റേണിന് കാരണമായേക്കാം, അതിനാൽ ഈ രീതി ക്വാണ്ടിറ്റേറ്റീവ് അല്ല. അടുത്തിടെ, ബയോആക്ടീവ് ഫ്ലൂറസെൻ (Fl)-ലേബൽ ചെയ്ത GA19,20 റൂട്ട് എൻഡോകോർട്ടെക്സിൽ GA യുടെ ശേഖരണവും GA ട്രാൻസ്പോർട്ട് വഴി അതിന്റെ സെല്ലുലാർ ലെവലുകൾ നിയന്ത്രിക്കുന്നതും വെളിപ്പെടുത്തി. അടുത്തിടെ, GA FRET സെൻസർ nlsGPS1, GA ലെവലുകൾ വേരുകൾ, ഫിലമെന്റുകൾ, ഇരുണ്ട നിറങ്ങളിൽ വളരുന്ന ഹൈപ്പോകോട്ടൈലുകൾ എന്നിവയിലെ കോശ നീളവുമായി ബന്ധപ്പെട്ടിരിക്കുന്നുവെന്ന് കാണിച്ചു21. എന്നിരുന്നാലും, നമ്മൾ കണ്ടതുപോലെ, GA സിഗ്നലിംഗ് പ്രവർത്തനത്തെ നിയന്ത്രിക്കുന്ന ഒരേയൊരു പാരാമീറ്റർ GA സാന്ദ്രതയല്ല, കാരണം ഇത് സങ്കീർണ്ണമായ സെൻസിംഗ് പ്രക്രിയകളെ ആശ്രയിച്ചിരിക്കുന്നു. ഇവിടെ, DELLA, GA സിഗ്നലിംഗ് പാതകളെക്കുറിച്ചുള്ള ഞങ്ങളുടെ ധാരണയെ അടിസ്ഥാനമാക്കി, GA സിഗ്നലിംഗിനായുള്ള ഒരു ഡീഗ്രഡേഷൻ അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള റേഷ്യോമെട്രിക് ബയോസെൻസറിന്റെ വികസനവും സ്വഭാവവും ഞങ്ങൾ റിപ്പോർട്ട് ചെയ്യുന്നു. ഈ ക്വാണ്ടിറ്റേറ്റീവ് ബയോസെൻസർ വികസിപ്പിക്കുന്നതിന്, ഒരു ഫ്ലൂറസെന്റ് പ്രോട്ടീനുമായി സംയോജിപ്പിച്ച് ടിഷ്യൂകളിൽ എല്ലായിടത്തും പ്രകടിപ്പിക്കുന്ന ഒരു മ്യൂട്ടന്റ് GA-സെൻസിറ്റീവ് RGA, അതുപോലെ തന്നെ ഒരു GA-ഇൻസെൻസിറ്റീവ് ഫ്ലൂറസെന്റ് പ്രോട്ടീൻ എന്നിവ ഞങ്ങൾ ഉപയോഗിച്ചു. മ്യൂട്ടന്റ് RGA പ്രോട്ടീൻ ഫ്യൂഷനുകൾ സർവ്വവ്യാപിയായി പ്രകടിപ്പിക്കുമ്പോൾ എൻഡോജെനസ് GA സിഗ്നലിംഗിനെ തടസ്സപ്പെടുത്തുന്നില്ലെന്നും ഉയർന്ന സ്പേഷ്യോടെമ്പറൽ റെസല്യൂഷനുള്ള സെൻസിംഗ് ഉപകരണം വഴി GA ഇൻപുട്ടിൽ നിന്നും GA സിഗ്നൽ പ്രോസസ്സിംഗിൽ നിന്നും ഉണ്ടാകുന്ന സിഗ്നലിംഗ് പ്രവർത്തനം അളക്കാൻ ഈ ബയോസെൻസറിന് കഴിയുമെന്നും ഞങ്ങൾ കാണിക്കുന്നു. GA സിഗ്നലിംഗ് പ്രവർത്തനത്തിന്റെ സ്പേഷ്യോടെമ്പറൽ വിതരണം മാപ്പ് ചെയ്യുന്നതിനും SAM എപ്പിഡെർമിസിൽ GA സെല്ലുലാർ പെരുമാറ്റത്തെ എങ്ങനെ നിയന്ത്രിക്കുന്നുവെന്ന് അളക്കുന്നതിനും ഞങ്ങൾ ഈ ബയോസെൻസർ ഉപയോഗിച്ചു. ഓർഗൻ പ്രൈമോർഡിയയ്‌ക്കിടയിൽ സ്ഥിതി ചെയ്യുന്ന SAM സെല്ലുകളുടെ ഡിവിഷൻ തലത്തിന്റെ ഓറിയന്റേഷൻ GA നിയന്ത്രിക്കുന്നുവെന്ന് ഞങ്ങൾ തെളിയിക്കുന്നു, അതുവഴി ഇന്റർനോഡിന്റെ കാനോനിക്കൽ സെല്ലുലാർ ഓർഗനൈസേഷൻ നിർവചിക്കുന്നു.
ഒടുവിൽ, വളരുന്ന ഹൈപ്പോകോട്ടൈലുകൾ ഉപയോഗിച്ച് എൻഡോജെനസ് GA ലെവലുകളിലെ മാറ്റങ്ങൾ റിപ്പോർട്ട് ചെയ്യാൻ qmRGA-യ്ക്ക് കഴിയുമോ എന്ന് ഞങ്ങൾ ചോദിച്ചു. GA സിന്തസിസ് വർദ്ധിപ്പിച്ച് നൈട്രേറ്റ് വളർച്ചയെ ഉത്തേജിപ്പിക്കുകയും, അതോടൊപ്പം, DELLA34 ഡീഗ്രഡേഷനും ചെയ്യുന്നുവെന്ന് ഞങ്ങൾ മുമ്പ് കാണിച്ചുതന്നു. അതനുസരിച്ച്, സമൃദ്ധമായ നൈട്രേറ്റ് വിതരണത്തിൽ (10 mM NO3−) വളരുന്ന pUBQ10::qmRGA തൈകളിലെ ഹൈപ്പോകോട്ടൈൽ നീളം നൈട്രേറ്റ് കുറവുള്ള സാഹചര്യങ്ങളിൽ വളരുന്ന തൈകളേക്കാൾ ഗണ്യമായി കൂടുതലാണെന്ന് ഞങ്ങൾ നിരീക്ഷിച്ചു (അനുബന്ധ ചിത്രം 6a). വളർച്ചാ പ്രതികരണത്തിന് അനുസൃതമായി, നൈട്രേറ്റിന്റെ അഭാവത്തിൽ വളരുന്ന തൈകളേക്കാൾ 10 mM NO3− സാഹചര്യങ്ങളിൽ വളരുന്ന തൈകളുടെ ഹൈപ്പോകോട്ടൈലുകളിൽ GA സിഗ്നലുകൾ കൂടുതലായിരുന്നു (അനുബന്ധ ചിത്രം 6b, c). അങ്ങനെ, GA സാന്ദ്രതയിലെ എൻഡോജെനസ് മാറ്റങ്ങളാൽ പ്രേരിതമായ GA സിഗ്നലിംഗിലെ മാറ്റങ്ങളുടെ നിരീക്ഷണവും qmRGA പ്രാപ്തമാക്കുന്നു.
സെൻസർ രൂപകൽപ്പനയെ അടിസ്ഥാനമാക്കി പ്രതീക്ഷിച്ചതുപോലെ, qmRGA കണ്ടെത്തിയ GA സിഗ്നലിംഗ് പ്രവർത്തനം GA സാന്ദ്രതയെയും GA ധാരണയെയും ആശ്രയിച്ചിരിക്കുന്നുണ്ടോ എന്ന് മനസ്സിലാക്കാൻ, സസ്യ, പ്രത്യുൽപാദന കലകളിലെ മൂന്ന് GID1 റിസപ്റ്ററുകളുടെ എക്സ്പ്രഷൻ ഞങ്ങൾ വിശകലനം ചെയ്തു. തൈകളിൽ, GID1a, c എന്നിവ കോട്ടിലെഡോണുകളിൽ വളരെ ഉയർന്ന അളവിൽ പ്രകടിപ്പിക്കപ്പെട്ടിട്ടുണ്ടെന്ന് GID1-GUS റിപ്പോർട്ടർ ലൈൻ കാണിച്ചു (ചിത്രം 3a–c). കൂടാതെ, മൂന്ന് റിസപ്റ്ററുകളും ഇലകൾ, ലാറ്ററൽ റൂട്ട് പ്രൈമോർഡിയ, റൂട്ട് ടിപ്പുകൾ (GID1b യുടെ റൂട്ട് ക്യാപ് ഒഴികെ), വാസ്കുലർ സിസ്റ്റം (ചിത്രം 3a–c) എന്നിവയിൽ പ്രകടിപ്പിക്കപ്പെട്ടു. പൂങ്കുല SAM-ൽ, GID1b, 1c എന്നിവയ്ക്കുള്ള GUS സിഗ്നലുകൾ മാത്രമേ ഞങ്ങൾ കണ്ടെത്തിയിട്ടുള്ളൂ (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം 7a–c). ഇൻ സിറ്റു ഹൈബ്രിഡൈസേഷൻ ഈ എക്സ്പ്രഷൻ പാറ്റേണുകൾ സ്ഥിരീകരിച്ചു, SAM-ൽ താഴ്ന്ന തലങ്ങളിൽ GID1c ഏകതാനമായി പ്രകടിപ്പിക്കപ്പെട്ടിട്ടുണ്ടെന്ന് കൂടുതൽ തെളിയിച്ചു, അതേസമയം GID1b SAM-ന്റെ ചുറ്റളവിൽ ഉയർന്ന എക്സ്പ്രഷൻ കാണിച്ചു (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം 7d–l). pGID1b::2xmTQ2-GID1b വിവർത്തന സംയോജനം, SAM ന്റെ മധ്യഭാഗത്ത് കുറഞ്ഞതോ ഇല്ലാത്തതോ ആയ എക്സ്പ്രഷൻ മുതൽ അവയവ അതിർത്തികളിൽ ഉയർന്ന എക്സ്പ്രഷൻ വരെ GID1b എക്സ്പ്രഷന്റെ ഒരു ഗ്രേഡഡ് ശ്രേണി വെളിപ്പെടുത്തി (അനുബന്ധ ചിത്രം 7m). അങ്ങനെ, GID1 റിസപ്റ്ററുകൾ ടിഷ്യൂകളിലുടനീളവും അകത്തും ഒരേപോലെ വിതരണം ചെയ്യപ്പെടുന്നില്ല. തുടർന്നുള്ള പരീക്ഷണങ്ങളിൽ, GID1 (pUBQ10::GID1a-mCherry) ന്റെ അമിത എക്സ്പ്രഷൻ ഹൈപ്പോകോട്ടൈലുകളിൽ qmRGA യുടെ സംവേദനക്ഷമത ബാഹ്യ GA ആപ്ലിക്കേഷനിലേക്ക് വർദ്ധിപ്പിച്ചതായും ഞങ്ങൾ നിരീക്ഷിച്ചു (ചിത്രം 3d, e). ഇതിനു വിപരീതമായി, ഹൈപ്പോകോട്ടൈലിൽ qd17mRGA അളക്കുന്ന ഫ്ലൂറസെൻസ് GA3 ചികിത്സയ്ക്ക് സെൻസിറ്റീവ് അല്ലായിരുന്നു (ചിത്രം 3f, g). രണ്ട് പരിശോധനകൾക്കും, GID1 റിസപ്റ്ററുമായി ബന്ധിപ്പിക്കാനുള്ള കഴിവ് വർദ്ധിപ്പിക്കുകയോ നഷ്ടപ്പെടുകയോ ചെയ്ത സെൻസറിന്റെ ദ്രുത സ്വഭാവം വിലയിരുത്തുന്നതിന് തൈകൾക്ക് ഉയർന്ന സാന്ദ്രതയിലുള്ള GA (100 μM GA3) നൽകി. ഈ ഫലങ്ങൾ ഒരുമിച്ച്, qmRGA ബയോസെൻസർ ഒരു GA, GA സെൻസർ എന്ന നിലയിൽ ഒരു സംയോജിത പ്രവർത്തനം നിർവ്വഹിക്കുന്നുവെന്ന് സ്ഥിരീകരിക്കുന്നു, കൂടാതെ GID1 റിസപ്റ്ററിന്റെ ഡിഫറൻഷ്യൽ എക്സ്പ്രഷന് സെൻസറിന്റെ എമിസിവിറ്റിയെ ഗണ്യമായി മോഡുലേറ്റ് ചെയ്യാൻ കഴിയുമെന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു.
ഇന്നുവരെ, SAM-ൽ GA സിഗ്നലുകളുടെ വിതരണം വ്യക്തമല്ല. അതിനാൽ, GA സിഗ്നലിംഗ് പ്രവർത്തനത്തിന്റെ ഉയർന്ന റെസല്യൂഷൻ ക്വാണ്ടിറ്റേറ്റീവ് മാപ്പുകൾ കണക്കാക്കാൻ ഞങ്ങൾ qmRGA-എക്സ്പ്രസ്സിംഗ് പ്ലാന്റുകളും pCLV3::mCherry-NLS സ്റ്റെം സെൽ റിപ്പോർട്ടറും ഉപയോഗിച്ചു, L1 ലെയറിൽ ശ്രദ്ധ കേന്ദ്രീകരിച്ചു (എപിഡെർമിസ്; ചിത്രം 4a, b, രീതികളും അനുബന്ധ രീതികളും കാണുക), കാരണം L1 SAM വളർച്ചയെ നിയന്ത്രിക്കുന്നതിൽ ഒരു പ്രധാന പങ്ക് വഹിക്കുന്നു36. ഇവിടെ, pCLV3::mCherry-NLS എക്സ്പ്രഷൻ GA സിഗ്നലിംഗ് പ്രവർത്തനത്തിന്റെ സ്പേഷ്യോടെമ്പറൽ വിതരണം വിശകലനം ചെയ്യുന്നതിനുള്ള ഒരു നിശ്ചിത ജ്യാമിതീയ റഫറൻസ് പോയിന്റ് നൽകി37. ലാറ്ററൽ അവയവ വികസനത്തിന് GA അത്യാവശ്യമാണെന്ന് കണക്കാക്കപ്പെടുന്നുണ്ടെങ്കിലും4, P3 ഘട്ടം മുതൽ ആരംഭിക്കുന്ന പുഷ്പ പ്രൈമോർഡിയത്തിൽ (P) GA സിഗ്നലുകൾ കുറവാണെന്ന് ഞങ്ങൾ നിരീക്ഷിച്ചു (ചിത്രം 4a, b), അതേസമയം യുവ P1, P2 പ്രൈമോർഡിയങ്ങൾക്ക് മധ്യമേഖലയിലേതിന് സമാനമായ മിതമായ പ്രവർത്തനം ഉണ്ടായിരുന്നു (ചിത്രം 4a, b). അവയവ പ്രൈമോർഡിയത്തിന്റെ അതിരുകളിൽ (അതിർത്തിയുടെ വശങ്ങളിൽ) P1/P2 ൽ ആരംഭിച്ച് P4 ൽ ഉച്ചസ്ഥായിയിലെത്തിയ ഉയർന്ന GA സിഗ്നലിംഗ് പ്രവർത്തനം കണ്ടെത്തി, അതുപോലെ പ്രൈമോർഡിയയ്ക്കിടയിൽ സ്ഥിതിചെയ്യുന്ന പെരിഫറൽ മേഖലയിലെ എല്ലാ കോശങ്ങളിലും (ചിത്രം 4a, b, സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം 8a, b). ഈ ഉയർന്ന GA സിഗ്നലിംഗ് പ്രവർത്തനം എപ്പിഡെർമിസിൽ മാത്രമല്ല, L2, മുകളിലെ L3 പാളികളിലും നിരീക്ഷിക്കപ്പെട്ടു (അനുബന്ധ ചിത്രം 8b). qmRGA ഉപയോഗിച്ച് SAM-ൽ കണ്ടെത്തിയ GA സിഗ്നലുകളുടെ പാറ്റേണും കാലക്രമേണ മാറ്റമില്ലാതെ തുടർന്നു (അനുബന്ധ ചിത്രം 8c–f, k). ഞങ്ങൾ വിശദമായി ചിത്രീകരിച്ച അഞ്ച് സ്വതന്ത്ര ലൈനുകളിൽ നിന്ന് T3 സസ്യങ്ങളുടെ SAM-ൽ qd17mRGA കൺസ്ട്രക്റ്റ് ക്രമാനുഗതമായി കുറച്ചുകാണിച്ചെങ്കിലും, pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP കൺസ്ട്രക്റ്റ് ഉപയോഗിച്ച് ലഭിച്ച ഫ്ലൂറസെൻസ് പാറ്റേണുകൾ വിശകലനം ചെയ്യാൻ ഞങ്ങൾക്ക് കഴിഞ്ഞു (അനുബന്ധ ചിത്രം 8g–j, l). ഈ നിയന്ത്രണ ലൈനിൽ, SAM-ൽ ഫ്ലൂറസെൻസ് അനുപാതത്തിൽ ചെറിയ മാറ്റങ്ങൾ മാത്രമേ കണ്ടെത്തിയിട്ടുള്ളൂ, എന്നാൽ SAM കേന്ദ്രത്തിൽ TagBFP-യുമായി ബന്ധപ്പെട്ട VENUS-ൽ വ്യക്തവും അപ്രതീക്ഷിതവുമായ കുറവ് ഞങ്ങൾ നിരീക്ഷിച്ചു. qmRGA നിരീക്ഷിച്ച സിഗ്നലിംഗ് പാറ്റേൺ mRGA-VENUS-ന്റെ GA-ആശ്രിത ഡീഗ്രഡേഷനെ പ്രതിഫലിപ്പിക്കുന്നുവെന്ന് ഇത് സ്ഥിരീകരിക്കുന്നു, മാത്രമല്ല qmRGA മെറിസ്റ്റം സെന്ററിലെ GA സിഗ്നലിംഗ് പ്രവർത്തനത്തെ അമിതമായി വിലയിരുത്തിയേക്കാം എന്നും ഇത് തെളിയിക്കുന്നു. ചുരുക്കത്തിൽ, പ്രാഥമികമായി പ്രൈമോർഡിയയുടെ വിതരണത്തെ പ്രതിഫലിപ്പിക്കുന്ന ഒരു GA സിഗ്നലിംഗ് പാറ്റേൺ ഞങ്ങളുടെ ഫലങ്ങൾ വെളിപ്പെടുത്തുന്നു. ഇന്റർ-പ്രൈമോർഡിയൽ മേഖലയുടെ (IPR) ഈ വിതരണം വികസ്വര പ്രൈമോർഡിയത്തിനും മധ്യ മേഖലയ്ക്കും ഇടയിൽ ഉയർന്ന GA സിഗ്നലിംഗ് പ്രവർത്തനം ക്രമേണ സ്ഥാപിക്കപ്പെടുന്നതിനാലാണ്, അതേസമയം പ്രൈമോർഡിയത്തിലെ GA സിഗ്നലിംഗ് പ്രവർത്തനം കുറയുന്നു (ചിത്രം 4c, d).
GID1b, GID1c റിസപ്റ്ററുകളുടെ വിതരണം (മുകളിൽ കാണുക) സൂചിപ്പിക്കുന്നത് GA റിസപ്റ്ററുകളുടെ ഡിഫറൻഷ്യൽ എക്സ്പ്രഷൻ SAM-ലെ GA സിഗ്നലിംഗ് പ്രവർത്തനത്തിന്റെ പാറ്റേൺ രൂപപ്പെടുത്താൻ സഹായിക്കുന്നു എന്നാണ്. GA-യുടെ ഡിഫറൻഷ്യൽ അക്യുമുലേഷൻ ഉൾപ്പെട്ടിരിക്കുമോ എന്ന് ഞങ്ങൾ ചിന്തിച്ചു. ഈ സാധ്യത അന്വേഷിക്കാൻ, ഞങ്ങൾ nlsGPS1 GA FRET സെൻസർ21 ഉപയോഗിച്ചു. 10 μM GA4+7 ഉപയോഗിച്ച് ചികിത്സിച്ച nlsGPS1 ന്റെ SAM-ൽ 100 ​​മിനിറ്റ് നേരത്തേക്ക് വർദ്ധിച്ച ആക്റ്റിവേഷൻ ഫ്രീക്വൻസി കണ്ടെത്തി (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം 9a–e), ഇത് റൂട്ടുകളിൽ ചെയ്യുന്നതുപോലെ SAM-ലെ GA സാന്ദ്രതയിലെ മാറ്റങ്ങളോട് nlsGPS1 പ്രതികരിക്കുന്നുവെന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു. nlsGPS1 ആക്റ്റിവേഷൻ ഫ്രീക്വൻസിയുടെ സ്പേഷ്യൽ ഡിസ്ട്രിബ്യൂഷൻ SAM-ന്റെ പുറം പാളികളിൽ താരതമ്യേന കുറഞ്ഞ GA ലെവലുകൾ വെളിപ്പെടുത്തി, പക്ഷേ അവ SAM-ന്റെ മധ്യത്തിലും അതിർത്തികളിലും ഉയർന്നിട്ടുണ്ടെന്ന് കാണിച്ചു (ചിത്രം 4e, അനുബന്ധ ചിത്രം 9a,c). qmRGA വെളിപ്പെടുത്തിയതിന് സമാനമായ ഒരു സ്പേഷ്യൽ പാറ്റേൺ ഉപയോഗിച്ച് SAM-ലും GA വിതരണം ചെയ്യുന്നുവെന്ന് ഇത് സൂചിപ്പിക്കുന്നു. ഒരു പൂരക സമീപനമെന്ന നിലയിൽ, ഞങ്ങൾ SAM-നെ ഫ്ലൂറസെന്റ് GA (GA3-, GA4-, GA7-Fl) അല്ലെങ്കിൽ Fl എന്നിവ നെഗറ്റീവ് നിയന്ത്രണമായി ഉപയോഗിച്ചു. കുറഞ്ഞ തീവ്രതയിൽ (ചിത്രം 4j, സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം 10d) സെൻട്രൽ റീജിയൻ, പ്രൈമോർഡിയം എന്നിവയുൾപ്പെടെ SAM-ൽ ഉടനീളം Fl സിഗ്നൽ വിതരണം ചെയ്തു. ഇതിനു വിപരീതമായി, മൂന്ന് GA-Fl-ഉം പ്രൈമോർഡിയം ബോർഡറുകൾക്കുള്ളിലും ബാക്കിയുള്ള IPR-ൽ വ്യത്യസ്ത അളവുകളിലും അടിഞ്ഞുകൂടി, IPR-ലെ ഏറ്റവും വലിയ ഡൊമെയ്‌നിൽ GA7-Fl അടിഞ്ഞുകൂടി (ചിത്രം 4k, സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം 10a,b). ഫ്ലൂറസെൻസ് തീവ്രതയുടെ അളവ് കണക്കാക്കുമ്പോൾ, Fl-ചികിത്സിച്ച SAM-നെ അപേക്ഷിച്ച് GA-Fl-ചികിത്സിച്ച SAM-ൽ IPR-ഇതര തീവ്രത അനുപാതം കൂടുതലാണെന്ന് കണ്ടെത്തി (ചിത്രം 4l, സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം 10c). ഈ ഫലങ്ങൾ ഒരുമിച്ച് സൂചിപ്പിക്കുന്നത് അവയവ അതിർത്തിയോട് ഏറ്റവും അടുത്തായി സ്ഥിതി ചെയ്യുന്ന IPR കോശങ്ങളിൽ ഉയർന്ന സാന്ദ്രതയിലാണ് GA ഉള്ളതെന്ന്. ഇത് സൂചിപ്പിക്കുന്നത് SAM GA സിഗ്നലിംഗ് പ്രവർത്തനത്തിന്റെ പാറ്റേൺ അവയവ അതിർത്തികൾക്ക് സമീപമുള്ള IPR കോശങ്ങളിലെ GA റിസപ്റ്ററുകളുടെ ഡിഫറൻഷ്യൽ എക്സ്പ്രഷനിൽ നിന്നും GA യുടെ ഡിഫറൻഷ്യൽ അക്യുമുലേഷനിൽ നിന്നുമാണ് ഉണ്ടാകുന്നത് എന്നാണ്. അങ്ങനെ, ഞങ്ങളുടെ വിശകലനം GA സിഗ്നലിംഗിന്റെ ഒരു അപ്രതീക്ഷിത സ്പേഷ്യോടെമ്പറൽ പാറ്റേൺ വെളിപ്പെടുത്തി, SAM ന്റെ മധ്യഭാഗത്തും പ്രൈമോർഡിയത്തിലും കുറഞ്ഞ പ്രവർത്തനവും പെരിഫറൽ മേഖലയിലെ IPR-ൽ ഉയർന്ന പ്രവർത്തനവും ഉണ്ടായിരുന്നു.
SAM-ൽ ഡിഫറൻഷ്യൽ GA സിഗ്നലിംഗ് പ്രവർത്തനത്തിന്റെ പങ്ക് മനസ്സിലാക്കാൻ, SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS-ന്റെ റിയൽ-ടൈം ടൈം-ലാപ്സ് ഇമേജിംഗ് ഉപയോഗിച്ച് GA സിഗ്നലിംഗ് പ്രവർത്തനം, കോശ വികാസം, കോശ വിഭജനം എന്നിവ തമ്മിലുള്ള പരസ്പരബന്ധം ഞങ്ങൾ വിശകലനം ചെയ്തു. വളർച്ചാ നിയന്ത്രണത്തിൽ GA-യുടെ പങ്ക് കണക്കിലെടുത്ത്, കോശ വികാസ പാരാമീറ്ററുകളുമായി ഒരു പോസിറ്റീവ് പരസ്പരബന്ധം പ്രതീക്ഷിച്ചിരുന്നു. അതിനാൽ, ഞങ്ങൾ ആദ്യം GA സിഗ്നലിംഗ് പ്രവർത്തന മാപ്പുകളെ കോശ ഉപരിതല വളർച്ചാ നിരക്കിന്റെ മാപ്പുകളുമായും (ഒരു നിശ്ചിത കോശത്തിനും വിഭജനത്തിലെ പുത്രി കോശങ്ങൾക്കും കോശ വികാസത്തിന്റെ ശക്തിയുടെ പ്രോക്സിയായി) കോശ വികാസത്തിന്റെ ദിശാബോധം അളക്കുന്ന വളർച്ചാ അനിസോട്രോപ്പിയുടെ മാപ്പുകളുമായും താരതമ്യം ചെയ്തു (ഒരു നിശ്ചിത കോശത്തിനും വിഭജനത്തിലെ പുത്രി കോശങ്ങൾക്കും ഇവിടെ ഉപയോഗിക്കുന്നു; ചിത്രം 5a,b, രീതികളും അനുബന്ധ രീതികളും കാണുക). SAM സെൽ ഉപരിതല വളർച്ചാ നിരക്കിന്റെ ഞങ്ങളുടെ മാപ്പുകൾ മുൻ നിരീക്ഷണങ്ങളുമായി പൊരുത്തപ്പെടുന്നു38,39, അതിർത്തിയിൽ കുറഞ്ഞ വളർച്ചാ നിരക്കും വികസിച്ചുകൊണ്ടിരിക്കുന്ന പൂക്കളിൽ പരമാവധി വളർച്ചാ നിരക്കും (ചിത്രം 5a). GA സിഗ്നലിംഗ് പ്രവർത്തനം കോശ ഉപരിതല വളർച്ചാ തീവ്രതയുമായി നെഗറ്റീവ് പരസ്പരബന്ധിതമാണെന്ന് പ്രധാന ഘടക വിശകലനം (PCA) കാണിച്ചു (ചിത്രം 5c). GA സിഗ്നലിംഗ് ഇൻപുട്ടും വളർച്ചാ തീവ്രതയും ഉൾപ്പെടെയുള്ള വ്യതിയാനത്തിന്റെ പ്രധാന അക്ഷങ്ങൾ ഉയർന്ന CLV3 എക്സ്പ്രഷൻ നിർണ്ണയിക്കുന്ന ദിശയ്ക്ക് ഓർത്തോഗണൽ ആണെന്നും, ശേഷിക്കുന്ന വിശകലനങ്ങളിൽ SAM സെന്ററിൽ നിന്ന് കോശങ്ങളെ ഒഴിവാക്കുന്നത് സ്ഥിരീകരിച്ചുവെന്നും ഞങ്ങൾ കാണിച്ചു. സ്പിയർമാൻ പരസ്പരബന്ധ വിശകലനം PCA ഫലങ്ങൾ സ്ഥിരീകരിച്ചു (ചിത്രം 5d), IPR-ലെ ഉയർന്ന GA സിഗ്നലുകൾ ഉയർന്ന കോശ വികാസത്തിന് കാരണമായില്ലെന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു. എന്നിരുന്നാലും, പരസ്പരബന്ധ വിശകലനം GA സിഗ്നലിംഗ് പ്രവർത്തനത്തിനും വളർച്ചാ അനിസോട്രോപ്പിക്കും ഇടയിൽ ഒരു ചെറിയ പോസിറ്റീവ് പരസ്പരബന്ധം വെളിപ്പെടുത്തി (ചിത്രം 5c, d), IPR-ലെ ഉയർന്ന GA സിഗ്നലിംഗ് കോശ വളർച്ചയുടെ ദിശയെയും ഒരുപക്ഷേ കോശ വിഭജന തലത്തിന്റെ സ്ഥാനത്തെയും സ്വാധീനിക്കുന്നുവെന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു.
a, b SAM-ലെ ശരാശരി ഉപരിതല വളർച്ച (a), വളർച്ചാ അനിസോട്രോപ്പി (b) എന്നിവയുടെ ഹീറ്റ് മാപ്പുകൾ ഏഴ് സ്വതന്ത്ര സസ്യങ്ങളിൽ (യഥാക്രമം കോശ വികാസത്തിന്റെ ശക്തിക്കും ദിശയ്ക്കും പ്രോക്സികളായി ഉപയോഗിക്കുന്നു) ശരാശരി ഉപയോഗിച്ചു. c PCA വിശകലനത്തിൽ ഇനിപ്പറയുന്ന വേരിയബിളുകൾ ഉൾപ്പെടുന്നു: GA സിഗ്നൽ, ഉപരിതല വളർച്ചാ തീവ്രത, ഉപരിതല വളർച്ചാ അനിസോട്രോപ്പി, CLV3 എക്സ്പ്രഷൻ. PCA ഘടകം 1 പ്രധാനമായും ഉപരിതല വളർച്ചാ തീവ്രതയുമായി നെഗറ്റീവ് ആയി ബന്ധപ്പെട്ടിരിക്കുന്നു, കൂടാതെ GA സിഗ്നലുമായി പോസിറ്റീവ് ആയി ബന്ധപ്പെട്ടിരിക്കുന്നു. PCA ഘടകം 2 പ്രധാനമായും ഉപരിതല വളർച്ചാ അനിസോട്രോപ്പിയുമായി പോസിറ്റീവ് ആയി ബന്ധപ്പെട്ടിരിക്കുന്നു, കൂടാതെ CLV3 എക്സ്പ്രഷനുമായി നെഗറ്റീവ് ആയി ബന്ധപ്പെട്ടിരിക്കുന്നു. ഓരോ ഘടകവും വിശദീകരിച്ച വ്യതിയാനത്തെ ശതമാനങ്ങൾ പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നു. cZ ഒഴികെയുള്ള ടിഷ്യു സ്കെയിലിൽ GA സിഗ്നൽ, ഉപരിതല വളർച്ചാ തീവ്രത, ഉപരിതല വളർച്ചാ അനിസോട്രോപ്പി എന്നിവ തമ്മിലുള്ള സ്പിയർമാൻ പരസ്പരബന്ധ വിശകലനം. വലതുവശത്തുള്ള സംഖ്യ രണ്ട് വേരിയബിളുകൾക്കിടയിലുള്ള സ്പിയർമാൻ റോ മൂല്യമാണ്. പരസ്പരബന്ധം/നെഗറ്റീവ് പരസ്പരബന്ധം വളരെ പ്രാധാന്യമുള്ള സാഹചര്യങ്ങളെ നക്ഷത്രചിഹ്നങ്ങൾ സൂചിപ്പിക്കുന്നു. കോൺഫോക്കൽ മൈക്രോസ്കോപ്പി വഴി Col-0 SAM L1 സെല്ലുകളുടെ 3D ദൃശ്യവൽക്കരണം. 10 മണിക്കൂറിൽ SAM-ൽ (പക്ഷേ പ്രൈമോർഡിയമല്ല) രൂപം കൊള്ളുന്ന പുതിയ സെൽ ഭിത്തികൾ അവയുടെ ആംഗിൾ മൂല്യങ്ങൾക്കനുസരിച്ച് നിറമുള്ളതാണ്. താഴെ വലത് കോണിൽ കളർ ബാർ കാണിച്ചിരിക്കുന്നു. ഇൻസെറ്റ് 0 മണിക്കൂറിൽ അനുബന്ധ 3D ചിത്രം കാണിക്കുന്നു. പരീക്ഷണം രണ്ടുതവണ ആവർത്തിച്ചു, സമാനമായ ഫലങ്ങൾ ലഭിച്ചു. f ബോക്സ് പ്ലോട്ടുകൾ IPR-ലും നോൺ-IPR Col-0 SAM-ലും സെൽ ഡിവിഷൻ നിരക്കുകൾ പ്രദർശിപ്പിക്കുന്നു (n = 10 സ്വതന്ത്ര സസ്യങ്ങൾ). മധ്യരേഖ മീഡിയൻ കാണിക്കുന്നു, ബോക്സ് അതിരുകൾ 25-ഉം 75-ഉം ശതമാനങ്ങളെ സൂചിപ്പിക്കുന്നു. R സോഫ്റ്റ്‌വെയർ ഉപയോഗിച്ച് നിർണ്ണയിക്കപ്പെട്ട ഏറ്റവും കുറഞ്ഞതും കൂടിയതുമായ മൂല്യങ്ങളെ വിസ്‌കറുകൾ സൂചിപ്പിക്കുന്നു. വെൽച്ചിന്റെ ടു-ടെയിൽഡ് ടി-ടെസ്റ്റ് ഉപയോഗിച്ചാണ് പി മൂല്യങ്ങൾ ലഭിച്ചത്. g, h SAM-ന്റെ മധ്യത്തിൽ നിന്നുള്ള റേഡിയൽ ദിശയുമായി ബന്ധപ്പെട്ട് പുതിയ സെൽ മതിലിന്റെ (മജന്ത) കോൺ എങ്ങനെ അളക്കാമെന്ന് (g) കാണിക്കുന്ന സ്കീമാറ്റിക് ഡയഗ്രം (വെളുത്ത ഡോട്ടഡ് ലൈൻ) (അക്യൂട്ട് ആംഗിൾ മൂല്യങ്ങൾ, അതായത്, 0–90° മാത്രമേ പരിഗണിക്കൂ), (h) മെറിസ്റ്റമിനുള്ളിലെ സർക്കംഫറൻഷ്യൽ/ലാറ്ററൽ, റേഡിയൽ ദിശകൾ. i യഥാക്രമം SAM (കടും നീല), IPR (ഇടത്തരം നീല), നോൺ-IPR (ഇളം നീല) എന്നിവയിലുടനീളമുള്ള സെൽ ഡിവിഷൻ പ്ലെയിൻ ഓറിയന്റേഷന്റെ ഫ്രീക്വൻസി ഹിസ്റ്റോഗ്രാമുകൾ. രണ്ട് വാലുള്ള കോൾമോഗോറോവ്-സ്മിർനോവ് പരിശോധനയിലൂടെയാണ് പി മൂല്യങ്ങൾ ലഭിച്ചത്. സമാനമായ ഫലങ്ങളുമായി പരീക്ഷണം രണ്ടുതവണ ആവർത്തിച്ചു. j യഥാക്രമം P3 (ഇളം പച്ച), P4 (ഇടത്തരം പച്ച), P5 (ഇരുണ്ട പച്ച) എന്നിവയ്ക്ക് ചുറ്റുമുള്ള IPR ന്റെ സെൽ ഡിവിഷൻ പ്ലെയിൻ ഓറിയന്റേഷന്റെ ഫ്രീക്വൻസി ഹിസ്റ്റോഗ്രാമുകൾ. രണ്ട് വാലുള്ള കോൾമോഗോറോവ്-സ്മിർനോവ് പരിശോധനയിലൂടെയാണ് പി മൂല്യങ്ങൾ ലഭിച്ചത്. സമാനമായ ഫലങ്ങളുമായി പരീക്ഷണം രണ്ടുതവണ ആവർത്തിച്ചു.
അതിനാൽ, അടുത്തതായി, പരിശോധനയ്ക്കിടെ പുതുതായി രൂപംകൊണ്ട സെൽ മതിലുകൾ തിരിച്ചറിഞ്ഞുകൊണ്ട് GA സിഗ്നലിംഗും കോശ വിഭജന പ്രവർത്തനവും തമ്മിലുള്ള പരസ്പരബന്ധം ഞങ്ങൾ അന്വേഷിച്ചു (ചിത്രം 5e). ഈ സമീപനം കോശ വിഭജനത്തിന്റെ ആവൃത്തിയും ദിശയും അളക്കാൻ ഞങ്ങളെ അനുവദിച്ചു. അതിശയകരമെന്നു പറയട്ടെ, IPR-ലെയും SAM-ന്റെ ബാക്കി ഭാഗങ്ങളിലും (നോൺ-IPR, ചിത്രം 5f) കോശ വിഭജനങ്ങളുടെ ആവൃത്തി സമാനമാണെന്ന് ഞങ്ങൾ കണ്ടെത്തി, ഇത് IPR-ഉം നോൺ-IPR കോശങ്ങളും തമ്മിലുള്ള GA സിഗ്നലിംഗിലെ വ്യത്യാസങ്ങൾ കോശ വിഭജനത്തെ കാര്യമായി ബാധിക്കുന്നില്ലെന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു. ഇതും GA സിഗ്നലിംഗും വളർച്ചാ അനിസോട്രോപ്പിയും തമ്മിലുള്ള പോസിറ്റീവ് പരസ്പരബന്ധവും, GA സിഗ്നലിംഗ് പ്രവർത്തനത്തിന് കോശ വിഭജന തലത്തിന്റെ ഓറിയന്റേഷനെ സ്വാധീനിക്കാൻ കഴിയുമോ എന്ന് പരിഗണിക്കാൻ ഞങ്ങളെ പ്രേരിപ്പിച്ചു. മെറിസ്റ്റം സെന്ററിനെയും പുതിയ സെൽ ഭിത്തിയുടെ സെന്ററിനെയും ബന്ധിപ്പിക്കുന്ന റേഡിയൽ അച്ചുതണ്ടുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ ഒരു അക്യൂട്ട് കോൺ ആയി പുതിയ സെൽ ഭിത്തിയുടെ ഓറിയന്റേഷൻ ഞങ്ങൾ അളന്നു (ചിത്രം 5e-i), റേഡിയൽ അച്ചുതണ്ടുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ 90° കോണിനടുത്തുള്ള കോണുകളിൽ കോശങ്ങൾ വിഭജിക്കാനുള്ള വ്യക്തമായ പ്രവണത ഞങ്ങൾ നിരീക്ഷിച്ചു, ഏറ്റവും ഉയർന്ന ആവൃത്തികൾ 70–80° (23.28%) ഉം 80–90° (22.62%) ഉം (ചിത്രം 5e,i) ഉം ആയിരുന്നു, ഇത് സർക്കംഫറൻഷ്യൽ/തിരശ്ചീന ദിശയിലുള്ള സെൽ ഡിവിഷനുകൾക്ക് അനുസൃതമായിരുന്നു (ചിത്രം 5h). ഈ സെൽ ഡിവിഷൻ സ്വഭാവത്തിൽ GA സിഗ്നലിംഗിന്റെ സംഭാവന പരിശോധിക്കുന്നതിന്, IPR-ലെയും നോൺ-IPR-ലെയും സെൽ ഡിവിഷൻ പാരാമീറ്ററുകൾ ഞങ്ങൾ വെവ്വേറെ വിശകലനം ചെയ്തു (ചിത്രം 5i). IPR സെല്ലുകളിലെ ഡിവിഷൻ ആംഗിൾ ഡിസ്ട്രിബ്യൂഷൻ, SAM-ലെ മുഴുവൻ സെല്ലുകളിലും ഉള്ളതിൽ നിന്ന് വ്യത്യസ്തമാണെന്ന് ഞങ്ങൾ നിരീക്ഷിച്ചു, IPR സെല്ലുകൾ ലാറ്ററൽ/വൃത്താകൃതിയിലുള്ള സെൽ ഡിവിഷനുകളുടെ ഉയർന്ന അനുപാതം കാണിക്കുന്നു, അതായത്, 70–80° ഉം 80–90° ഉം (യഥാക്രമം 33.86% ഉം 30.71% ഉം, അനുബന്ധ അനുപാതങ്ങൾ) (ചിത്രം 5i). അങ്ങനെ, ഉയർന്ന GA സിഗ്നലിംഗും സർക്കിംഫറൻഷ്യൽ ദിശയ്ക്ക് സമീപമുള്ള ഒരു സെൽ ഡിവിഷൻ പ്ലെയിൻ ഓറിയന്റേഷനും തമ്മിലുള്ള ബന്ധം ഞങ്ങളുടെ നിരീക്ഷണങ്ങൾ വെളിപ്പെടുത്തി, GA സിഗ്നലിംഗ് പ്രവർത്തനവും വളർച്ചാ അനിസോട്രോപ്പിയും തമ്മിലുള്ള പരസ്പര ബന്ധത്തിന് സമാനമാണ് (ചിത്രം 5c, d). ഈ അസോസിയേഷന്റെ സ്പേഷ്യൽ കൺസർവേഷൻ കൂടുതൽ സ്ഥാപിക്കുന്നതിന്, P3 മുതൽ ആരംഭിക്കുന്ന പ്രൈമോർഡിയത്തിന് ചുറ്റുമുള്ള IPR സെല്ലുകളിലെ ഡിവിഷൻ പ്ലെയിൻ ഓറിയന്റേഷൻ ഞങ്ങൾ അളന്നു, കാരണം P4 മുതൽ ആരംഭിക്കുന്ന ഈ മേഖലയിൽ ഏറ്റവും ഉയർന്ന GA സിഗ്നലിംഗ് പ്രവർത്തനം കണ്ടെത്തി (ചിത്രം 4). P3, P4 എന്നിവയ്ക്ക് ചുറ്റുമുള്ള IPR-ന്റെ ഡിവിഷൻ ആംഗിളുകൾ സ്ഥിതിവിവരക്കണക്കനുസരിച്ച് കാര്യമായ വ്യത്യാസങ്ങളൊന്നും കാണിച്ചില്ല, എന്നിരുന്നാലും P4-ന് ചുറ്റുമുള്ള IPR-ൽ ലാറ്ററൽ സെൽ ഡിവിഷനുകളുടെ വർദ്ധിച്ച ആവൃത്തി നിരീക്ഷിക്കപ്പെട്ടു (ചിത്രം 5j). എന്നിരുന്നാലും, P5 ന് ചുറ്റുമുള്ള IPR സെല്ലുകളിൽ, കോശവിഭജന തലത്തിന്റെ ഓറിയന്റേഷനിലെ വ്യത്യാസം സ്ഥിതിവിവരക്കണക്കനുസരിച്ച് പ്രാധാന്യമർഹിക്കുന്നു, തിരശ്ചീന കോശവിഭജനങ്ങളുടെ ആവൃത്തിയിൽ കുത്തനെ വർദ്ധനവുണ്ടായി (ചിത്രം 5j). ഈ ഫലങ്ങൾ ഒരുമിച്ച് സൂചിപ്പിക്കുന്നത് GA സിഗ്നലിംഗിന് SAM-ലെ കോശവിഭജനങ്ങളുടെ ഓറിയന്റേഷൻ നിയന്ത്രിക്കാൻ കഴിയുമെന്നാണ്, ഇത് ഉയർന്ന GA സിഗ്നലിംഗിന് IPR-ലെ കോശവിഭജനങ്ങളുടെ ലാറ്ററൽ ഓറിയന്റേഷന് പ്രേരിപ്പിക്കാൻ കഴിയുമെന്ന മുൻ റിപ്പോർട്ടുകളുമായി പൊരുത്തപ്പെടുന്നു.
IPR-ലെ കോശങ്ങൾ പ്രൈമോർഡിയയിലേക്ക് സംയോജിപ്പിക്കപ്പെടില്ല, മറിച്ച് ഇന്റേണുകളിലേക്ക് ഉൾപ്പെടുത്തപ്പെടുമെന്ന് പ്രവചിക്കപ്പെടുന്നു2,42,43. IPR-ലെ കോശവിഭജനങ്ങളുടെ തിരശ്ചീന ഓറിയന്റേഷൻ ഇന്റേണുകളിലെ എപ്പിഡെർമൽ കോശങ്ങളുടെ സമാന്തര രേഖാംശ നിരകളുടെ സാധാരണ ഓർഗനൈസേഷനിലേക്ക് നയിച്ചേക്കാം. മുകളിൽ വിവരിച്ച ഞങ്ങളുടെ നിരീക്ഷണങ്ങൾ സൂചിപ്പിക്കുന്നത് കോശവിഭജനത്തിന്റെ ദിശ നിയന്ത്രിക്കുന്നതിലൂടെ GA സിഗ്നലിംഗ് ഈ പ്രക്രിയയിൽ ഒരു പങ്കു വഹിക്കാൻ സാധ്യതയുണ്ട് എന്നാണ്.
നിരവധി DELLA ജീനുകളുടെ പ്രവർത്തനം നഷ്ടപ്പെടുന്നത് ഒരു കോൺസ്റ്റിറ്റ്യൂറ്റീവ് GA പ്രതികരണത്തിന് കാരണമാകുന്നു, കൂടാതെ ഈ സിദ്ധാന്തം പരീക്ഷിക്കാൻ ഡെല്ല മ്യൂട്ടന്റുകൾ ഉപയോഗിക്കാം44. SAM-ലെ അഞ്ച് DELLA ജീനുകളുടെ എക്സ്പ്രഷൻ പാറ്റേണുകൾ ഞങ്ങൾ ആദ്യം വിശകലനം ചെയ്തു. GUS ലൈനിന്റെ ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷണൽ ഫ്യൂഷൻ45 GAI, RGA, RGL1, RGL2 (വളരെ കുറഞ്ഞ അളവിൽ) എന്നിവ SAM-ൽ പ്രകടിപ്പിക്കപ്പെട്ടിട്ടുണ്ടെന്ന് വെളിപ്പെടുത്തി (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം 11a–d). ഇൻ സിറ്റു ഹൈബ്രിഡൈസേഷൻ GAI mRNA പ്രത്യേകിച്ച് പ്രൈമോർഡിയയിലും വികസ്വര പൂക്കളിലും അടിഞ്ഞുകൂടുന്നുവെന്ന് കൂടുതൽ തെളിയിച്ചു (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം 11e). SAM മേലാപ്പിലുടനീളം RGL1 ഉം RGL3 mRNAയും കണ്ടെത്തി, അതേസമയം RGL2 mRNA അതിർത്തി മേഖലയിൽ കൂടുതൽ സമൃദ്ധമായിരുന്നു (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം 11f–h). pRGL3::RGL3-GFP SAM-ന്റെ കോൺഫോക്കൽ ഇമേജിംഗ് ഇൻ സിറ്റു ഹൈബ്രിഡൈസേഷൻ നിരീക്ഷിച്ച എക്സ്പ്രഷൻ സ്ഥിരീകരിച്ചു, SAM-ന്റെ മധ്യഭാഗത്ത് RGL3 പ്രോട്ടീൻ അടിഞ്ഞുകൂടുന്നുവെന്ന് കാണിച്ചു (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം 11i). pRGA::GFP-RGA ലൈൻ ഉപയോഗിച്ച്, SAM-ൽ RGA പ്രോട്ടീൻ അടിഞ്ഞുകൂടുന്നുണ്ടെന്നും, എന്നാൽ P4 മുതൽ ആരംഭിക്കുന്ന അതിർത്തിയിൽ അതിന്റെ സമൃദ്ധി കുറയുന്നുവെന്നും ഞങ്ങൾ കണ്ടെത്തി (അനുബന്ധ ചിത്രം 11j). ശ്രദ്ധേയമായി, RGL3, RGA എന്നിവയുടെ എക്സ്പ്രഷൻ പാറ്റേണുകൾ qmRGA കണ്ടെത്തിയതുപോലെ IPR-ലെ ഉയർന്ന GA സിഗ്നലിംഗ് പ്രവർത്തനവുമായി പൊരുത്തപ്പെടുന്നു (ചിത്രം 4). മാത്രമല്ല, എല്ലാ DELLA-കളും SAM-ൽ പ്രകടിപ്പിക്കപ്പെടുന്നുവെന്നും അവയുടെ എക്സ്പ്രഷൻ മൊത്തത്തിൽ മുഴുവൻ SAM-ലും വ്യാപിക്കുന്നുവെന്നും ഈ ഡാറ്റ സൂചിപ്പിക്കുന്നു.
അടുത്തതായി ഞങ്ങൾ വൈൽഡ്-ടൈപ്പ് SAM (Ler, control), gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della quintuple (global) മ്യൂട്ടന്റുകളിലെ സെൽ ഡിവിഷൻ പാരാമീറ്ററുകൾ വിശകലനം ചെയ്തു (ചിത്രം 6a, b). രസകരമെന്നു പറയട്ടെ, വൈൽഡ് തരവുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ ഡെല്ല ഗ്ലോബൽ മ്യൂട്ടന്റ് SAM-ലെ സെൽ ഡിവിഷൻ ആംഗിൾ ഫ്രീക്വൻസികളുടെ വിതരണത്തിൽ സ്ഥിതിവിവരക്കണക്കനുസരിച്ച് കാര്യമായ മാറ്റം ഞങ്ങൾ നിരീക്ഷിച്ചു (ചിത്രം 6c). ഡെല്ല ഗ്ലോബൽ മ്യൂട്ടന്റിലെ ഈ മാറ്റം 80–90° കോണുകളുടെ (34.71% vs. 24.55%) ആവൃത്തിയിലെ വർദ്ധനവും ഒരു പരിധിവരെ 70–80° കോണുകളുടെ (23.78% vs. 20.18%) ആവൃത്തിയും മൂലമാണ്, അതായത്, തിരശ്ചീന സെൽ ഡിവിഷനുകൾക്ക് അനുസൃതമായി (ചിത്രം 6c). ഡെല്ല ഗ്ലോബൽ മ്യൂട്ടന്റിൽ നോൺ-ട്രാൻസ്‌വേഴ്‌സ് ഡിവിഷനുകളുടെ (0–60°) ആവൃത്തിയും കുറവായിരുന്നു (ചിത്രം 6c). ഡെല്ല ഗ്ലോബൽ മ്യൂട്ടന്റിന്റെ SAM-ൽ തിരശ്ചീന കോശ വിഭജനങ്ങളുടെ ആവൃത്തി ഗണ്യമായി വർദ്ധിച്ചു (ചിത്രം 6b). വൈൽഡ് തരവുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ ഡെല്ല ഗ്ലോബൽ മ്യൂട്ടന്റിൽ IPR-ലെ തിരശ്ചീന കോശ വിഭജനങ്ങളുടെ ആവൃത്തിയും കൂടുതലായിരുന്നു (ചിത്രം 6d). IPR മേഖലയ്ക്ക് പുറത്ത്, വൈൽഡ് തരത്തിന് കോശ വിഭജന കോണുകളുടെ കൂടുതൽ ഏകീകൃത വിതരണം ഉണ്ടായിരുന്നു, അതേസമയം ഡെല്ല ഗ്ലോബൽ മ്യൂട്ടന്റ് IPR (ചിത്രം 6e) പോലുള്ള ടാൻജെൻഷ്യൽ ഡിവിഷനുകളെയാണ് ഇഷ്ടപ്പെട്ടത്. GA അടിഞ്ഞുകൂടുന്ന GA-നിഷ്ക്രിയ മ്യൂട്ടന്റ് പശ്ചാത്തലമായ ga2 ഓക്സിഡേസ് (ga2ox) ക്വിന്റപ്പിൾ മ്യൂട്ടന്റുകളുടെ (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1, ga2ox6-2) SAM-ലെ കോശ വിഭജനങ്ങളുടെ ഓറിയന്റേഷൻ ഞങ്ങൾ കണക്കാക്കി. GA ലെവലുകളിലെ വർദ്ധനവിന് അനുസൃതമായി, ക്വിന്റപ്പിൾ ga2ox മ്യൂട്ടന്റ് പൂങ്കുലയുടെ SAM, Col-0 നേക്കാൾ വലുതായിരുന്നു (അനുബന്ധ ചിത്രം 12a, b), കൂടാതെ Col-0 നെ അപേക്ഷിച്ച്, ക്വിന്റപ്പിൾ ga2ox SAM, കോശ വിഭജന കോണുകളുടെ വ്യക്തമായ വ്യത്യസ്തമായ വിതരണം കാണിച്ചു, ആംഗിൾ ഫ്രീക്വൻസി 50° മുതൽ 90° വരെ വർദ്ധിച്ചു, അതായത് വീണ്ടും ടാൻജെൻഷ്യൽ ഡിവിഷനുകളെ അനുകൂലിക്കുന്നു (അനുബന്ധ ചിത്രം 12a–c). അങ്ങനെ, GA സിഗ്നലിംഗിന്റെയും GA ശേഖരണത്തിന്റെയും കോൺസ്റ്റിറ്റ്യൂട്ടീവ് ആക്റ്റിവേഷൻ IPR ലും SAM ന്റെ ബാക്കി ഭാഗങ്ങളിലും ലാറ്ററൽ സെൽ ഡിവിഷനുകളെ പ്രേരിപ്പിക്കുന്നുവെന്ന് ഞങ്ങൾ കാണിക്കുന്നു.
a, b കോൺഫോക്കൽ മൈക്രോസ്കോപ്പി ഉപയോഗിച്ച് PI-സ്റ്റെയിൻ ചെയ്ത Ler (a) ഉം ഗ്ലോബൽ ഡെല്ല മ്യൂട്ടന്റ് (b) SAM ഉം L1 ലെയറിന്റെ 3D ദൃശ്യവൽക്കരണം. 10-h കാലയളവിൽ SAM-ൽ (എന്നാൽ പ്രൈമോർഡിയം അല്ല) രൂപം കൊള്ളുന്ന പുതിയ സെൽ ഭിത്തികൾ കാണിക്കുകയും അവയുടെ ആംഗിൾ മൂല്യങ്ങൾക്കനുസരിച്ച് നിറം നൽകുകയും ചെയ്യുന്നു. ഇൻസെറ്റ് 0 h-ൽ SAM കാണിക്കുന്നു. താഴെ വലത് കോണിൽ കളർ ബാർ പ്രദർശിപ്പിച്ചിരിക്കുന്നു. (b) ലെ അമ്പടയാളം ആഗോള ഡെല്ല മ്യൂട്ടന്റിലെ വിന്യസിച്ച സെൽ ഫയലുകളുടെ ഒരു ഉദാഹരണത്തിലേക്ക് വിരൽ ചൂണ്ടുന്നു. സമാനമായ ഫലങ്ങളോടെ പരീക്ഷണം രണ്ടുതവണ ആവർത്തിച്ചു. ലെറിനും ഗ്ലോബൽ ഡെല്ലയ്ക്കും ഇടയിലുള്ള മുഴുവൻ SAM (d), IPR (e), നോൺ-IPR (f) എന്നിവയിലെ സെൽ ഡിവിഷൻ പ്ലെയിൻ ഓറിയന്റേഷനുകളുടെ ആവൃത്തി വിതരണത്തിന്റെ താരതമ്യം. രണ്ട് വാലുള്ള കോൾമോഗോറോവ്-സ്മിർനോവ് ടെസ്റ്റ് ഉപയോഗിച്ചാണ് പി മൂല്യങ്ങൾ ലഭിച്ചത്. f, g Col-0 (i) ഉം pCUC2 ഉം ട്രാൻസ്ജെനിക് സസ്യങ്ങളുടെ PI-സ്റ്റെയിൻ ചെയ്ത SAM-ന്റെ കോൺഫോക്കൽ ചിത്രങ്ങളുടെ 3D ദൃശ്യവൽക്കരണം::gai-1-VENUS (j) ട്രാൻസ്ജെനിക് സസ്യങ്ങളും. പാനലുകൾ (a, b) 10 മണിക്കൂറിനുള്ളിൽ SAM-ൽ രൂപംകൊണ്ട പുതിയ കോശഭിത്തികൾ (പക്ഷേ പ്രൈമോർഡിയ അല്ല) കാണിക്കുന്നു. പരീക്ഷണം രണ്ടുതവണ ആവർത്തിച്ചു, സമാനമായ ഫലങ്ങൾ ലഭിച്ചു. h–j Col-0, pCUC2::gai-1-VENUS സസ്യങ്ങൾക്കിടയിലുള്ള മുഴുവൻ SAM (h), IPR (i), നോൺ-IPR (j) എന്നിവയിലും സ്ഥിതി ചെയ്യുന്ന കോശവിഭജന തല ഓറിയന്റേഷനുകളുടെ ആവൃത്തി വിതരണത്തിന്റെ താരതമ്യം. രണ്ട് വാലുള്ള Kolmogorov–Smirnov പരിശോധന ഉപയോഗിച്ചാണ് P മൂല്യങ്ങൾ ലഭിച്ചത്.
അടുത്തതായി, IPR-ൽ GA സിഗ്നലിംഗിനെ തടയുന്നതിന്റെ പ്രഭാവം പ്രത്യേകമായി ഞങ്ങൾ പരീക്ഷിച്ചു. ഇതിനായി, VENUS-ലേക്ക് സംയോജിപ്പിച്ച ഒരു പ്രബലമായ നെഗറ്റീവ് gai-1 പ്രോട്ടീന്റെ എക്സ്പ്രഷൻ നയിക്കാൻ ഞങ്ങൾ cotyledon cup 2 (CUC2) പ്രൊമോട്ടർ ഉപയോഗിച്ചു (pCUC2::gai-1-VENUS ലൈനിൽ). വൈൽഡ്-ടൈപ്പ് SAM-ൽ, P4 മുതൽ ബോർഡർ സെല്ലുകൾ ഉൾപ്പെടെ SAM-ലെ മിക്ക IPR-കളുടെയും എക്സ്പ്രഷൻ CUC2 പ്രൊമോട്ടർ ഡ്രൈവ് ചെയ്യുന്നു, കൂടാതെ pCUC2::gai-1-VENUS സസ്യങ്ങളിലും സമാനമായ നിർദ്ദിഷ്ട എക്സ്പ്രഷൻ നിരീക്ഷിക്കപ്പെട്ടു (താഴെ കാണുക). pCUC2::gai-1-VENUS സസ്യങ്ങളുടെ SAM അല്ലെങ്കിൽ IPR-ലുടനീളമുള്ള കോശവിഭജന കോണുകളുടെ വിതരണം വൈൽഡ് തരത്തിൽ നിന്ന് കാര്യമായ വ്യത്യാസമൊന്നും കാണിച്ചില്ല, എന്നിരുന്നാലും അപ്രതീക്ഷിതമായി ഈ സസ്യങ്ങളിലെ IPR ഇല്ലാത്ത കോശങ്ങൾ 80–90° ഉയർന്ന ആവൃത്തിയിൽ വിഭജിക്കപ്പെട്ടിട്ടുണ്ടെന്ന് ഞങ്ങൾ കണ്ടെത്തി (ചിത്രം 6f–j).
കോശവിഭജനത്തിന്റെ ദിശ SAM-ന്റെ ജ്യാമിതിയെ ആശ്രയിച്ചിരിക്കുന്നുവെന്ന് നിർദ്ദേശിക്കപ്പെട്ടിട്ടുണ്ട്, പ്രത്യേകിച്ച് ടിഷ്യു വക്രതയാൽ സൃഷ്ടിക്കപ്പെടുന്ന ടെൻസൈൽ സമ്മർദ്ദം46. അതിനാൽ ഡെല്ല ഗ്ലോബൽ മ്യൂട്ടന്റ്, pCUC2::gai-1-VENUS സസ്യങ്ങളിൽ SAM-ന്റെ ആകൃതിയിൽ മാറ്റം വന്നിട്ടുണ്ടോ എന്ന് ഞങ്ങൾ ചോദിച്ചു. മുമ്പ് റിപ്പോർട്ട് ചെയ്തതുപോലെ12, ഡെല്ല ഗ്ലോബൽ മ്യൂട്ടന്റ് SAM-ന്റെ വലുപ്പം വൈൽഡ് തരത്തേക്കാൾ വലുതായിരുന്നു (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം 13a, b, d). CLV3, STM RNA എന്നിവയുടെ ഇൻ സിറ്റു ഹൈബ്രിഡൈസേഷൻ ഡെല്ല മ്യൂട്ടന്റുകളിലെ മെറിസ്റ്റം വികാസം സ്ഥിരീകരിക്കുകയും സ്റ്റെം സെൽ നിച്ചിന്റെ ലാറ്ററൽ വികാസം കൂടുതൽ കാണിക്കുകയും ചെയ്തു (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം 13e, f, h, i). എന്നിരുന്നാലും, രണ്ട് ജനിതകരൂപങ്ങളിലും SAM വക്രത സമാനമായിരുന്നു (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം 13k, m, n, p). വൈൽഡ് ടൈപ്പുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ വക്രതയിൽ മാറ്റമൊന്നുമില്ലാതെ gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della quadruple mutant-ൽ സമാനമായ വലുപ്പ വർദ്ധനവ് ഞങ്ങൾ നിരീക്ഷിച്ചു (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം 13c, d, g, j, l, o, p). ഡെല്ല ക്വാഡ്രപ്പിൾ മ്യൂട്ടന്റിലും കോശവിഭജന ഓറിയന്റേഷൻ ആവൃത്തിയെ ബാധിച്ചു, പക്ഷേ ഡെല്ല മോണോലിത്തിക് മ്യൂട്ടന്റിനേക്കാൾ കുറഞ്ഞ അളവിൽ (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം 12d-f). വക്രതയിൽ ഒരു പ്രഭാവത്തിന്റെ അഭാവത്തോടൊപ്പം, ഈ ഡോസേജ് ഇഫക്റ്റ് സൂചിപ്പിക്കുന്നത് ഡെല്ല ക്വാഡ്രപ്പിൾ മ്യൂട്ടന്റിലെ ശേഷിക്കുന്ന RGL3 പ്രവർത്തനം DELLA പ്രവർത്തനത്തിന്റെ നഷ്ടം മൂലമുണ്ടാകുന്ന കോശവിഭജന ഓറിയന്റേഷനിലെ മാറ്റങ്ങളെ പരിമിതപ്പെടുത്തുന്നുവെന്നും SAM ജ്യാമിതിയിലെ മാറ്റങ്ങളേക്കാൾ GA സിഗ്നലിംഗ് പ്രവർത്തനത്തിലെ മാറ്റങ്ങളോടുള്ള പ്രതികരണമായാണ് ലാറ്ററൽ സെൽ ഡിവിഷനുകളിലെ മാറ്റങ്ങൾ സംഭവിക്കുന്നതെന്നും. മുകളിൽ വിവരിച്ചതുപോലെ, CUC2 പ്രൊമോട്ടർ P4-ൽ നിന്ന് ആരംഭിക്കുന്ന SAM-ൽ IPR എക്സ്പ്രഷൻ നയിക്കുന്നു (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം 14a, b), ഇതിനു വിപരീതമായി, pCUC2::gai-1-VENUS SAM-ന് കുറഞ്ഞ വലിപ്പമുണ്ടെങ്കിലും ഉയർന്ന വക്രത ഉണ്ടായിരുന്നു (സപ്ലിമെന്ററി ചിത്രം 14c–h). pCUC2::gai-1-VENUS SAM രൂപഘടനയിലെ ഈ മാറ്റം വൈൽഡ് തരവുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ മെക്കാനിക്കൽ സമ്മർദ്ദങ്ങളുടെ വ്യത്യസ്തമായ വിതരണത്തിന് കാരണമായേക്കാം, അതിൽ ഉയർന്ന ചുറ്റളവ് സമ്മർദ്ദങ്ങൾ SAM കേന്ദ്രത്തിൽ നിന്ന് കുറഞ്ഞ ദൂരത്തിൽ ആരംഭിക്കുന്നു47. പകരമായി, pCUC2::gai-1-VENUS SAM രൂപഘടനയിലെ മാറ്റങ്ങൾ ട്രാൻസ്ജീൻ എക്സ്പ്രഷൻ വഴി പ്രേരിതമായ പ്രാദേശിക മെക്കാനിക്കൽ ഗുണങ്ങളിലെ മാറ്റങ്ങളുടെ ഫലമായിരിക്കാം48. രണ്ട് സാഹചര്യങ്ങളിലും, സർക്കംഫറൻഷ്യൽ/ട്രാൻസ്‌വേഴ്‌സ് ഓറിയന്റേഷനിൽ കോശങ്ങൾ വിഭജിക്കാനുള്ള സാധ്യത വർദ്ധിപ്പിച്ചുകൊണ്ട് GA സിഗ്നലിംഗിലെ മാറ്റങ്ങളുടെ ഫലങ്ങളെ ഇത് ഭാഗികമായി ഓഫ്‌സെറ്റ് ചെയ്‌തേക്കാം, ഇത് ഞങ്ങളുടെ നിരീക്ഷണങ്ങളെ വിശദീകരിക്കുന്നു.
ഒരുമിച്ച് നോക്കുമ്പോൾ, ഉയർന്ന GA സിഗ്നലിംഗ് IPR-ലെ കോശവിഭജന തലത്തിന്റെ ലാറ്ററൽ ഓറിയന്റേഷനിൽ സജീവ പങ്ക് വഹിക്കുന്നുണ്ടെന്ന് ഞങ്ങളുടെ ഡാറ്റ സ്ഥിരീകരിക്കുന്നു. മെറിസ്റ്റം വക്രത IPR-ലെ കോശവിഭജന തലത്തിന്റെ ഓറിയന്റേഷനെയും സ്വാധീനിക്കുന്നുണ്ടെന്നും അവ കാണിക്കുന്നു.
ഉയർന്ന GA സിഗ്നലിംഗ് പ്രവർത്തനം കാരണം IPR-ലെ ഡിവിഷൻ തലത്തിന്റെ തിരശ്ചീന ഓറിയന്റേഷൻ സൂചിപ്പിക്കുന്നത്, പിന്നീട് എപ്പിഡെർമൽ ഇന്റർനോഡിൽ കാണപ്പെടുന്ന സെല്ലുലാർ ഓർഗനൈസേഷനെ നിർവചിക്കുന്നതിന് GA, SAM-നുള്ളിലെ എപ്പിഡെർമിസിൽ ഒരു റേഡിയൽ സെൽ ഫയൽ മുൻകൂട്ടി ക്രമീകരിക്കുന്നു എന്നാണ്. വാസ്തവത്തിൽ, ഡെല്ല ഗ്ലോബൽ മ്യൂട്ടന്റുകളുടെ SAM ചിത്രങ്ങളിൽ അത്തരം സെൽ ഫയലുകൾ പതിവായി ദൃശ്യമായിരുന്നു (ചിത്രം 6b). അങ്ങനെ, SAM-ലെ GA സിഗ്നലിംഗിന്റെ സ്പേഷ്യൽ പാറ്റേണിന്റെ വികസന പ്രവർത്തനം കൂടുതൽ പര്യവേക്ഷണം ചെയ്യുന്നതിന്, വൈൽഡ്-ടൈപ്പ് (Ler, Col-0), ഡെല്ല ഗ്ലോബൽ മ്യൂട്ടന്റുകൾ, pCUC2::gai-1-VENUS ട്രാൻസ്ജെനിക് സസ്യങ്ങൾ എന്നിവയിലെ IPR-ലെ കോശങ്ങളുടെ സ്പേഷ്യൽ ഓർഗനൈസേഷൻ വിശകലനം ചെയ്യാൻ ഞങ്ങൾ ടൈം-ലാപ്സ് ഇമേജിംഗ് ഉപയോഗിച്ചു.
IPR-ലെ GA സിഗ്നലിംഗ് പ്രവർത്തനം P1/P2-ൽ നിന്ന് വർദ്ധിച്ച് P4-ൽ എത്തിയതായി qmRGA കാണിച്ചതായി ഞങ്ങൾ കണ്ടെത്തി, കാലക്രമേണ ഈ പാറ്റേൺ സ്ഥിരമായി തുടർന്നു (ചിത്രം 4a–f ഉം അനുബന്ധ ചിത്രം 8c–f, k ഉം). GA സിഗ്നൽ വർദ്ധിക്കുന്ന IPR-ലെ കോശങ്ങളുടെ സ്പേഷ്യൽ ഓർഗനൈസേഷൻ വിശകലനം ചെയ്യുന്നതിന്, ആദ്യ നിരീക്ഷണത്തിന് ശേഷം 34 മണിക്കൂർ വിശകലനം ചെയ്ത അവയുടെ വികസന വിധി അനുസരിച്ച്, അതായത്, രണ്ടിൽ കൂടുതൽ പ്ലാസ്റ്റിഡ് സമയങ്ങൾ, P1/P2 മുതൽ P4 വരെയുള്ള പ്രൈമോർഡിയം വികസന സമയത്ത് IPR കോശങ്ങളെ പിന്തുടരാൻ ഞങ്ങളെ അനുവദിച്ചുകൊണ്ട്, P4-ന് മുകളിലും വശങ്ങളിലും Ler IPR സെല്ലുകൾ ഞങ്ങൾ ലേബൽ ചെയ്തു. ഞങ്ങൾ മൂന്ന് വ്യത്യസ്ത നിറങ്ങൾ ഉപയോഗിച്ചു: P4-ന് സമീപമുള്ള പ്രൈമോർഡിയത്തിൽ സംയോജിപ്പിച്ച കോശങ്ങൾക്ക് മഞ്ഞ, IPR-ൽ ഉണ്ടായിരുന്നവയ്ക്ക് പച്ച, രണ്ട് പ്രക്രിയകളിലും പങ്കെടുത്തവയ്ക്ക് പർപ്പിൾ (ചിത്രം 7a–c). t0-ൽ (0 h), P4-ന് മുന്നിൽ IPR കോശങ്ങളുടെ 1-2 പാളികൾ ദൃശ്യമായിരുന്നു (ചിത്രം 7a). പ്രതീക്ഷിച്ചതുപോലെ, ഈ കോശങ്ങൾ വിഭജിക്കപ്പെട്ടപ്പോൾ, അവ പ്രധാനമായും തിരശ്ചീന വിഭജന തലം വഴിയാണ് അങ്ങനെ ചെയ്തത് (ചിത്രം 7a–c). Col-0 SAM ഉപയോഗിച്ച് സമാനമായ ഫലങ്ങൾ ലഭിച്ചു (P3-ൽ ശ്രദ്ധ കേന്ദ്രീകരിച്ച്, അതിന്റെ അതിർത്തി Ler-ൽ P4-ന് സമാനമായി മടക്കുന്നു), എന്നിരുന്നാലും ഈ ജനിതകരൂപത്തിൽ പുഷ്പ അതിർത്തിയിൽ രൂപപ്പെട്ട മടക്ക് IPR കോശങ്ങളെ കൂടുതൽ വേഗത്തിൽ മറച്ചു (ചിത്രം 7g–i). അങ്ങനെ, IPR കോശങ്ങളുടെ വിഭജന രീതി കോശങ്ങളെ ഇന്റർനോഡുകളിലെന്നപോലെ റേഡിയൽ വരികളായി മുൻകൂട്ടി ക്രമീകരിക്കുന്നു. റേഡിയൽ വരികളുടെ ഓർഗനൈസേഷനും തുടർച്ചയായ അവയവങ്ങൾക്കിടയിലുള്ള IPR കോശങ്ങളുടെ പ്രാദേശികവൽക്കരണവും ഈ കോശങ്ങൾ ഇന്റർനോഡൽ പ്രോജെനിറ്ററുകളാണെന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു.
ഇവിടെ, ഞങ്ങൾ ഒരു റേഷ്യോമെട്രിക് GA സിഗ്നലിംഗ് ബയോസെൻസർ, qmRGA വികസിപ്പിച്ചെടുത്തു, ഇത് സംയോജിത GA, GA റിസപ്റ്റർ സാന്ദ്രതകളിൽ നിന്ന് ഉണ്ടാകുന്ന GA സിഗ്നലിംഗ് പ്രവർത്തനത്തിന്റെ ക്വാണ്ടിറ്റേറ്റീവ് മാപ്പിംഗ് അനുവദിക്കുന്നു, അതേസമയം എൻഡോജെനസ് സിഗ്നലിംഗ് പാതകളുമായുള്ള ഇടപെടൽ കുറയ്ക്കുകയും അതുവഴി സെല്ലുലാർ തലത്തിൽ GA പ്രവർത്തനത്തെക്കുറിച്ചുള്ള വിവരങ്ങൾ നൽകുകയും ചെയ്യുന്നു. ഇതിനായി, ഞങ്ങൾ ഒരു പരിഷ്കരിച്ച DELLA പ്രോട്ടീൻ, mRGA നിർമ്മിച്ചു, അത് DELLA ഇന്ററാക്ഷൻ പങ്കാളികളെ ബന്ധിപ്പിക്കാനുള്ള കഴിവ് നഷ്ടപ്പെട്ടു, പക്ഷേ GA-ഇൻഡ്യൂസ്ഡ് പ്രോട്ടിയോളിസിസിനോട് സംവേദനക്ഷമതയുള്ളതായി തുടരുന്നു. qmRGA GA ലെവലുകളിലെ ബാഹ്യവും അന്തർലീനവുമായ മാറ്റങ്ങളോട് പ്രതികരിക്കുന്നു, കൂടാതെ അതിന്റെ ചലനാത്മക സെൻസിംഗ് ഗുണങ്ങൾ വികസന സമയത്ത് GA സിഗ്നലിംഗ് പ്രവർത്തനത്തിലെ സ്പേഷ്യോടെമ്പറൽ മാറ്റങ്ങളുടെ വിലയിരുത്തൽ പ്രാപ്തമാക്കുന്നു. qmRGA വളരെ വഴക്കമുള്ള ഒരു ഉപകരണമാണ്, കാരണം അതിന്റെ എക്സ്പ്രഷനായി ഉപയോഗിക്കുന്ന പ്രൊമോട്ടറെ മാറ്റുന്നതിലൂടെ (ആവശ്യമെങ്കിൽ) വ്യത്യസ്ത ടിഷ്യൂകളുമായി ഇത് പൊരുത്തപ്പെടുത്താൻ കഴിയും, കൂടാതെ GA സിഗ്നലിംഗ് പാതയുടെ സംരക്ഷിത സ്വഭാവവും ആൻജിയോസ്‌പെർമുകളിലുടനീളം PFYRE മോട്ടിഫും കണക്കിലെടുക്കുമ്പോൾ, ഇത് മറ്റ് സ്പീഷീസുകളിലേക്ക് കൈമാറ്റം ചെയ്യപ്പെടാൻ സാധ്യതയുണ്ട്22. ഇതിനു അനുസൃതമായി, അരിയിലെ SLR1 DELLA പ്രോട്ടീനിലെ (HYY497AAA) തുല്യമായ ഒരു മ്യൂട്ടേഷൻ SLR1 ന്റെ വളർച്ചാ പ്രതിബന്ധ പ്രവർത്തനത്തെ അടിച്ചമർത്തുകയും mRGA23 ന് സമാനമായി അതിന്റെ GA- മധ്യസ്ഥ ഡീഗ്രഡേഷൻ ചെറുതായി കുറയ്ക്കുകയും ചെയ്യുന്നതായി കണ്ടെത്തി. ശ്രദ്ധേയമായി, അറബിഡോപ്സിസിലെ സമീപകാല പഠനങ്ങൾ കാണിക്കുന്നത് PFYRE ഡൊമെയ്‌നിലെ (S474L) ഒരൊറ്റ അമിനോ ആസിഡ് മ്യൂട്ടേഷൻ ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ ഫാക്ടർ പങ്കാളികളുമായി ഇടപഴകാനുള്ള RGA യുടെ ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷണൽ പ്രവർത്തനത്തെ മാറ്റിമറിച്ചു എന്നാണ്50. ഈ മ്യൂട്ടേഷൻ mRGA യിൽ നിലവിലുള്ള 3 അമിനോ ആസിഡ് പകരക്കാർക്ക് വളരെ അടുത്താണെങ്കിലും, ഈ രണ്ട് മ്യൂട്ടേഷനുകളും DELLA യുടെ വ്യത്യസ്ത സ്വഭാവസവിശേഷതകളെ മാറ്റുന്നുവെന്ന് ഞങ്ങളുടെ പഠനങ്ങൾ കാണിക്കുന്നു. മിക്ക ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷൻ ഫാക്ടർ പങ്കാളികളും DELLA26,51 ന്റെ LHR1, SAW ഡൊമെയ്‌നുകളുമായി ബന്ധിപ്പിക്കുന്നുണ്ടെങ്കിലും, PFYRE ഡൊമെയ്‌നിലെ ചില സംരക്ഷിത അമിനോ ആസിഡുകൾ ഈ ഇടപെടലുകളെ സ്ഥിരപ്പെടുത്താൻ സഹായിച്ചേക്കാം.
സസ്യ വാസ്തുവിദ്യയിലും വിളവ് മെച്ചപ്പെടുത്തലിലും ഇന്റർനോഡ് വികസനം ഒരു പ്രധാന സ്വഭാവമാണ്. IPR ഇന്റർനോഡ് പ്രോജെനിറ്റർ സെല്ലുകളിൽ ഉയർന്ന GA സിഗ്നലിംഗ് പ്രവർത്തനം qmRGA വെളിപ്പെടുത്തി. ക്വാണ്ടിറ്റേറ്റീവ് ഇമേജിംഗും ജനിതകശാസ്ത്രവും സംയോജിപ്പിച്ചുകൊണ്ട്, GA സിഗ്നലിംഗ് പാറ്റേണുകൾ SAM എപ്പിഡെർമിസിലെ വൃത്താകൃതിയിലുള്ള/തിരശ്ചീന കോശ വിഭജന തലങ്ങളെ സൂപ്പർഇമ്പോസ് ചെയ്യുന്നുവെന്ന് ഞങ്ങൾ കാണിച്ചു, ഇത് ഇന്റർനോഡ് വികസനത്തിന് ആവശ്യമായ കോശ വിഭജന ഓർഗനൈസേഷനെ രൂപപ്പെടുത്തുന്നു. വികസന സമയത്ത് കോശ വിഭജന തലം ഓറിയന്റേഷന്റെ നിരവധി റെഗുലേറ്ററുകൾ തിരിച്ചറിഞ്ഞിട്ടുണ്ട്52,53. GA സിഗ്നലിംഗ് പ്രവർത്തനം ഈ സെല്ലുലാർ പാരാമീറ്ററിനെ എങ്ങനെ നിയന്ത്രിക്കുന്നു എന്നതിന്റെ വ്യക്തമായ ഉദാഹരണം ഞങ്ങളുടെ പ്രവർത്തനം നൽകുന്നു. DELLA-യ്ക്ക് പ്രീഫോൾഡിംഗ് പ്രോട്ടീൻ കോംപ്ലക്സുകളുമായി ഇടപഴകാൻ കഴിയും41, അതിനാൽ GA സിഗ്നലിംഗ് കോർട്ടിക്കൽ മൈക്രോട്യൂബ്യൂൾ ഓറിയന്റേഷനെ നേരിട്ട് സ്വാധീനിച്ചുകൊണ്ട് കോശ വിഭജന തലം ഓറിയന്റേഷൻ നിയന്ത്രിക്കാൻ കഴിയും40,41,54,55. SAM-ൽ, ഉയർന്ന GA സിഗ്നലിംഗ് പ്രവർത്തനത്തിന്റെ പരസ്പരബന്ധം കോശ നീളം കൂട്ടലോ വിഭജനമോ അല്ല, മറിച്ച് വളർച്ചാ അനിസോട്രോപ്പി മാത്രമാണെന്ന് ഞങ്ങൾ അപ്രതീക്ഷിതമായി കാണിച്ചു, ഇത് IPR-ലെ കോശ വിഭജനത്തിന്റെ ദിശയിൽ GA യുടെ നേരിട്ടുള്ള സ്വാധീനവുമായി പൊരുത്തപ്പെടുന്നു. എന്നിരുന്നാലും, ഈ പ്രഭാവം പരോക്ഷമായും ഉണ്ടാകാമെന്ന് നമുക്ക് തള്ളിക്കളയാനാവില്ല, ഉദാഹരണത്തിന് GA-ഇൻഡ്യൂസ്ഡ് സെൽ വാൾ സോഫ്റ്റനിംഗ് വഴി മധ്യസ്ഥത വഹിക്കുന്നു56. സെൽ വാൾ ഗുണങ്ങളിലെ മാറ്റങ്ങൾ മെക്കാനിക്കൽ സ്ട്രെസ് ഉണ്ടാക്കുന്നു57,58, ഇത് കോർട്ടിക്കൽ മൈക്രോട്യൂബ്യൂളുകളുടെ ഓറിയന്റേഷനെ ബാധിച്ചുകൊണ്ട് സെൽ ഡിവിഷൻ തലത്തിന്റെ ഓറിയന്റേഷനെയും സ്വാധീനിക്കും39,46,59. ഇന്റർനോഡുകൾ നിർവചിക്കുന്നതിന് IPR-ൽ ഒരു പ്രത്യേക പാറ്റേൺ സെൽ ഡിവിഷൻ ഓറിയന്റേഷൻ സൃഷ്ടിക്കുന്നതിൽ GA-ഇൻഡ്യൂസ്ഡ് മെക്കാനിക്കൽ സ്ട്രെസിന്റെയും GA വഴി മൈക്രോട്യൂബ്യൂൾ ഓറിയന്റേഷന്റെ നേരിട്ടുള്ള നിയന്ത്രണത്തിന്റെയും സംയോജിത ഫലങ്ങൾ ഉൾപ്പെട്ടിരിക്കാം, കൂടാതെ ഈ ആശയം പരീക്ഷിക്കാൻ കൂടുതൽ പഠനങ്ങൾ ആവശ്യമാണ്. അതുപോലെ, ഇന്റർനോഡ് രൂപീകരണത്തിന്റെ നിയന്ത്രണത്തിൽ DELLA-ഇന്ററാക്ടിംഗ് പ്രോട്ടീനുകളായ TCP14 ഉം 15 ഉം 60,61 ന്റെ പ്രാധാന്യം മുൻ പഠനങ്ങൾ എടുത്തുകാണിച്ചിട്ടുണ്ട്, കൂടാതെ ഈ ഘടകങ്ങൾ ഇന്റർനോഡ് വികസനം നിയന്ത്രിക്കുകയും GA സിഗ്നലിംഗിനെ സ്വാധീനിക്കുന്നതായി കാണിക്കുകയും ചെയ്തിട്ടുള്ള BREVIPEDICELLUS (BP), PENNYWISE (PNY) എന്നിവയുമായി GA യുടെ പ്രവർത്തനത്തെ മധ്യസ്ഥമാക്കിയേക്കാം2,62. ഡെല്ലകൾ ബ്രാസിനോസ്റ്റീറോയിഡ്, എഥിലീൻ, ജാസ്മോണിക് ആസിഡ്, അബ്‌സിസിക് ആസിഡ് (ABA) സിഗ്നലിംഗ് പാതകളുമായി 63,64 ഇടപഴകുകയും ഈ ഹോർമോണുകൾക്ക് മൈക്രോട്യൂബ്യൂൾ ഓറിയന്റേഷനെ സ്വാധീനിക്കാൻ കഴിയുമെന്നും കണക്കിലെടുക്കുമ്പോൾ, കോശവിഭജന ഓറിയന്റേഷനിൽ GA യുടെ ഫലങ്ങൾ മറ്റ് ഹോർമോണുകളും മധ്യസ്ഥത വഹിച്ചേക്കാം.
ഇന്റേണോഡ് വികസനത്തിന് അറബിഡോപ്സിസ് SAM-ന്റെ ആന്തരികവും ബാഹ്യവുമായ ഭാഗങ്ങൾ ആവശ്യമാണെന്ന് ആദ്യകാല സൈറ്റോളജിക്കൽ പഠനങ്ങൾ തെളിയിച്ചിട്ടുണ്ട്2,42. ആന്തരിക കലകളിലെ കോശവിഭജനത്തെ GA സജീവമായി നിയന്ത്രിക്കുന്നു എന്ന വസ്തുത12 SAM-ലെ മെറിസ്റ്റമിനെയും ഇന്റേണോഡ് വലുപ്പത്തെയും നിയന്ത്രിക്കുന്നതിൽ GA-യുടെ ഇരട്ട പ്രവർത്തനത്തെ പിന്തുണയ്ക്കുന്നു. ആന്തരിക SAM ടിഷ്യുവിലും ദിശാസൂചന കോശവിഭജനത്തിന്റെ പാറ്റേൺ കർശനമായി നിയന്ത്രിക്കപ്പെടുന്നു, കൂടാതെ ഈ നിയന്ത്രണം സ്റ്റെം വളർച്ചയ്ക്ക് അത്യാവശ്യമാണ്52. ആന്തരിക SAM ഓർഗനൈസേഷനിൽ കോശവിഭജന തലം ഓറിയന്റുചെയ്യുന്നതിലും GA ഒരു പങ്കു വഹിക്കുന്നുണ്ടോ എന്ന് പരിശോധിക്കുന്നത് രസകരമായിരിക്കും, അതുവഴി SAM-നുള്ളിലെ ഇന്റേണോഡുകളുടെ സ്പെസിഫിക്കേഷനും വികസനവും സമന്വയിപ്പിക്കുന്നു.
സാധാരണ സാഹചര്യങ്ങളിൽ (16 മണിക്കൂർ വെളിച്ചം, 22 °C) 1% സുക്രോസും 1% അഗാറും (സിഗ്മ) ചേർത്ത 1x മുറാഷിഗെ-സ്കൂഗ് (എംഎസ്) മീഡിയം (ഡുഷെഫ) മണ്ണിലോ ഇൻ വിട്രോയിലോ സസ്യങ്ങൾ വളർത്തി. സ്ഥിരമായ വെളിച്ചത്തിലും 22 °C ലും ലംബ പ്ലേറ്റുകളിൽ തൈകൾ വളർത്തിയ ഹൈപ്പോകോട്ടൈൽ, റൂട്ട് വളർച്ചാ പരീക്ഷണങ്ങൾ ഒഴികെ. നൈട്രേറ്റ് പരീക്ഷണങ്ങൾക്ക്, ദീർഘകാല സാഹചര്യങ്ങളിൽ ആവശ്യത്തിന് നൈട്രേറ്റ് (0 അല്ലെങ്കിൽ 10 mM KNO3), 0.5 mM NH4-സക്സിനേറ്റ്, 1% സുക്രോസ്, 1% എ-അഗാർ (സിഗ്മ) എന്നിവ ചേർത്ത പരിഷ്കരിച്ച MS മീഡിയത്തിലാണ് (ബയോവേൾഡ് പ്ലാന്റ് മീഡിയം) സസ്യങ്ങൾ വളർത്തിയത്.
pDONR221-ൽ ചേർത്ത GID1a cDNA, pDONR P4-P1R-pUBQ10-ഉം pDONR P2R-P3-mCherry-ഉം pB7m34GW-ൽ ചേർത്ത് pUBQ10::GID1a-mCherry ജനറേറ്റ് ചെയ്തു. pDONR221-ൽ ചേർത്ത IDD2 DNA, pB7RWG266-ൽ ചേർത്ത് p35S:IDD2-RFP ജനറേറ്റ് ചെയ്തു. pGID1b::2xmTQ2-GID1b സൃഷ്ടിക്കുന്നതിന്, GID1b കോഡിംഗ് മേഖലയുടെ അപ്‌സ്ട്രീമിൽ 3.9 kb ഫ്രാഗ്മെന്റും GID1b cDNA (1.3 kb), ടെർമിനേറ്റർ (3.4 kb) എന്നിവ അടങ്ങിയ 4.7 kb ഫ്രാഗ്മെന്റും ആദ്യം സപ്ലിമെന്ററി ടേബിൾ 3 ലെ പ്രൈമറുകൾ ഉപയോഗിച്ച് ആംപ്ലിഫൈ ചെയ്തു, തുടർന്ന് യഥാക്രമം pDONR P4-P1R (തെർമോ ഫിഷർ സയന്റിഫിക്), pDONR P2R-P3 (തെർമോ ഫിഷർ സയന്റിഫിക്) എന്നിവയിൽ തിരുകി, ഒടുവിൽ ഗേറ്റ്‌വേ ക്ലോണിംഗ് ഉപയോഗിച്ച് pGreen 012567 ടാർഗെറ്റ് വെക്റ്ററിലേക്ക് pDONR221 2xmTQ268 ഉപയോഗിച്ച് വീണ്ടും സംയോജിപ്പിച്ചു. pCUC2::LSSmOrange ഉൽപ്പാദിപ്പിക്കുന്നതിന്, CUC2 പ്രൊമോട്ടർ സീക്വൻസ് (ATG യുടെ 3229 bp അപ്‌സ്ട്രീം) തുടർന്ന് N7 ന്യൂക്ലിയർ ലോക്കലൈസേഷൻ സിഗ്നലുള്ള വലിയ സ്റ്റോക്ക്സ്-ഷിഫ്റ്റ് ചെയ്ത mOrange (LSSmOrange)69 ന്റെ കോഡിംഗ് സീക്വൻസും NOS ട്രാൻസ്ക്രിപ്ഷണൽ ടെർമിനേറ്ററും ഗേറ്റ്‌വേ 3-ഫ്രാഗ്മെന്റ് റീകോമ്പിനേഷൻ സിസ്റ്റം (ഇൻവിട്രോജൻ) ഉപയോഗിച്ച് pGreen kanamycin ടാർഗെറ്റിംഗ് വെക്റ്ററിലേക്ക് കൂട്ടിച്ചേർക്കപ്പെട്ടു. പ്ലാന്റ് ബൈനറി വെക്റ്റർ അഗ്രോബാക്ടീരിയം ട്യൂമെഫാസിയൻസ് സ്ട്രെയിൻ GV3101 ലേക്ക് കൊണ്ടുവന്നു, അഗ്രോബാക്ടീരിയം ഇൻഫിൽട്രേഷൻ രീതിയിലൂടെ നിക്കോട്ടിയാന ബെന്താമിയാന ഇലകളിലേക്കും ഫ്ലോറൽ ഡിപ്പ് രീതിയിലൂടെ അറബിഡോപ്സിസ് താലിയാന Col-0 ലേക്ക് കൊണ്ടുവന്നു. pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry, pCLV3::mCherry-NLS qmRGA എന്നിവ യഥാക്രമം അതത് ക്രോസുകളുടെ F3, F1 സന്തതികളിൽ നിന്ന് വേർതിരിച്ചു.
ഏകദേശം 1 സെ.മീ നീളമുള്ള മുള നുറുങ്ങുകളിലാണ് ആർ‌എൻ‌എ ഇൻ സിറ്റു ഹൈബ്രിഡൈസേഷൻ നടത്തിയത്72, ഇവ ശേഖരിച്ച് എഫ്‌എ‌എ ലായനിയിൽ (3.7% ഫോർമാൽഡിഹൈഡ്, 5% അസറ്റിക് ആസിഡ്, 50% എത്തനോൾ) 4 °C വരെ പ്രീ-തണുപ്പിച്ച് ഉടനടി ഉറപ്പിച്ചു. 2 × 15 മിനിറ്റ് വാക്വം ചികിത്സകൾക്ക് ശേഷം, ഫിക്സേറ്റീവ് മാറ്റി സാമ്പിളുകൾ രാത്രി മുഴുവൻ ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്തു. റോസിയർ തുടങ്ങിയവർ വിവരിച്ചതുപോലെ സപ്ലിമെന്ററി പട്ടിക 3 ൽ കാണിച്ചിരിക്കുന്ന പ്രൈമറുകൾ ഉപയോഗിച്ച് GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2, RGL3 cDNA-കളും അവയുടെ 3′-UTR-കളിലേക്കുള്ള ആന്റിസെൻസ് പ്രോബുകളും സമന്വയിപ്പിച്ചു. ഡിഗോക്സിജെനിൻ-ലേബൽ ചെയ്ത പ്രോബുകൾ ഡിഗോക്സിജെനിൻ ആന്റിബോഡികൾ (3000-ഫോൾഡ് ഡൈല്യൂഷൻ; റോഷ്, കാറ്റലോഗ് നമ്പർ: 11 093 274 910) ഉപയോഗിച്ച് ഇമ്മ്യൂണോഡെറ്റക്റ്റ് ചെയ്തു, കൂടാതെ 5-ബ്രോമോ-4-ക്ലോറോ-3-ഇൻഡോലൈൽ ഫോസ്ഫേറ്റ് (ബിസിഐപി, 250-ഫോൾഡ് ഡൈല്യൂഷൻ)/നൈട്രോബ്ലൂ ടെട്രാസോളിയം (എൻബിടി, 200-ഫോൾഡ് ഡൈല്യൂഷൻ) ലായനി ഉപയോഗിച്ച് ഭാഗങ്ങൾ സ്റ്റെയിൻ ചെയ്തു.