സെന്റ് ജോൺസ് വോർട്ടിലെ ഇൻ വിട്രോ ഓർഗനോജെനിസിസിലും ബയോആക്ടീവ് സംയുക്തങ്ങളുടെ ഉൽപാദനത്തിലും സസ്യവളർച്ചാ നിയന്ത്രണങ്ങളുടെയും ഇരുമ്പ് ഓക്സൈഡ് നാനോകണങ്ങളുടെയും സിനർജിസ്റ്റിക് ഫലങ്ങൾ.

ഈ പഠനത്തിൽ, സംയോജിത ചികിത്സയുടെ ഉത്തേജക ഫലങ്ങൾസസ്യവളർച്ചാ നിയന്ത്രണ ഉപകരണങ്ങൾ*ഹൈപ്പറിക്കം പെർഫോറാറ്റം* L ലെ ഇൻ വിട്രോ മോർഫോജെനിസിസിനെയും ദ്വിതീയ മെറ്റബോളൈറ്റ് ഉൽപാദനത്തെയും കുറിച്ചുള്ള (2,4-D, കൈനെറ്റിൻ) ഇരുമ്പ് ഓക്സൈഡ് നാനോപാർട്ടിക്കിളുകൾ (Fe₃O₄-NPs) പരിശോധിച്ചു. ഒപ്റ്റിമൈസ് ചെയ്ത ചികിത്സ [2,4-D (0.5 mg/L) + കൈനെറ്റിൻ (2 mg/L) + Fe₃O₄-NPs (4 mg/L)] സസ്യവളർച്ച പാരാമീറ്ററുകൾ ഗണ്യമായി മെച്ചപ്പെടുത്തി: കൺട്രോൾ ഗ്രൂപ്പുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ സസ്യ ഉയരം 59.6% വർദ്ധിച്ചു, വേരിന്റെ നീളം 114.0% വർദ്ധിച്ചു, മുകുളങ്ങളുടെ എണ്ണം 180.0% വർദ്ധിച്ചു, കാലസ് പുതിയ ഭാരം 198.3% വർദ്ധിച്ചു. ഈ സംയോജിത ചികിത്സ പുനരുജ്ജീവന കാര്യക്ഷമത (50.85%) വർദ്ധിപ്പിക്കുകയും ഹൈപ്പറിസിൻ ഉള്ളടക്കം 66.6% വർദ്ധിപ്പിക്കുകയും ചെയ്തു. ജിസി-എംഎസ് വിശകലനത്തിൽ ഹൈപ്പറോസൈഡ്, β-പാത്തോലിൻ, സെറ്റൈൽ ആൽക്കഹോൾ എന്നിവയുടെ ഉയർന്ന ഉള്ളടക്കം കണ്ടെത്തി, ഇത് മൊത്തം പീക്ക് ഏരിയയുടെ 93.36% വരും, അതേസമയം മൊത്തം ഫിനോളിക്സുകളുടെയും ഫ്ലേവനോയ്ഡുകളുടെയും ഉള്ളടക്കം 80.1% വരെ വർദ്ധിച്ചു. ഈ ഫലങ്ങൾ സൂചിപ്പിക്കുന്നത് സസ്യവളർച്ചാ നിയന്ത്രണ ഘടകങ്ങളും (PGRs) Fe₃O₄ നാനോപാർട്ടിക്കിളുകളും (Fe₃O₄-NPs) ജൈവോൽപ്പാദനത്തെയും ജൈവശാസ്ത്രപരമായി സജീവമായ സംയുക്തങ്ങളുടെ ശേഖരണത്തെയും ഉത്തേജിപ്പിക്കുന്നതിലൂടെ ഒരു സിനർജിസ്റ്റിക് പ്രഭാവം ചെലുത്തുന്നു എന്നാണ്, ഇത് ഔഷധ സസ്യങ്ങളുടെ ജൈവ സാങ്കേതിക പുരോഗതിക്കുള്ള ഒരു വാഗ്ദാന തന്ത്രത്തെ പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നു.
സെന്റ് ജോൺസ് വോർട്ട് (ഹൈപ്പറിക്കം പെർഫോറാറ്റം എൽ.), സെന്റ് ജോൺസ് വോർട്ട് എന്നും അറിയപ്പെടുന്നു, ഇത് ഹൈപ്പറിക്കേസി കുടുംബത്തിലെ ഒരു വറ്റാത്ത സസ്യമാണ്, ഇതിന് സാമ്പത്തിക മൂല്യമുണ്ട്.[1] പ്രകൃതിദത്ത ടാന്നിനുകൾ, സാന്തോൺസ്, ഫ്ലോറോഗ്ലൂസിനോൾ, നാഫ്തലനെഡിയൻത്രോൺ (ഹൈപ്പറിൻ, സ്യൂഡോഹൈപ്പറിൻ), ഫ്ലേവനോയ്ഡുകൾ, ഫിനോളിക് ആസിഡുകൾ, അവശ്യ എണ്ണകൾ എന്നിവ ഇതിന്റെ ജൈവശാസ്ത്രപരമായി സജീവമായ ഘടകങ്ങളിൽ ഉൾപ്പെടുന്നു.[2,3,4] പരമ്പരാഗത രീതികളിലൂടെ സെന്റ് ജോൺസ് വോർട്ട് പ്രചരിപ്പിക്കാൻ കഴിയും; എന്നിരുന്നാലും, പരമ്പരാഗത രീതികളുടെ ഋതുഭേദം, കുറഞ്ഞ വിത്ത് മുളയ്ക്കൽ, രോഗങ്ങൾക്കുള്ള സാധ്യത എന്നിവ വലിയ തോതിലുള്ള കൃഷിക്കും ദ്വിതീയ മെറ്റബോളിറ്റുകളുടെ തുടർച്ചയായ രൂപീകരണത്തിനുമുള്ള അതിന്റെ സാധ്യതയെ പരിമിതപ്പെടുത്തുന്നു.[1,5,6]
അതിനാൽ, സസ്യങ്ങളുടെ ദ്രുതഗതിയിലുള്ള വ്യാപനം, ജേംപ്ലാസം വിഭവങ്ങളുടെ സംരക്ഷണം, ഔഷധ സംയുക്തങ്ങളുടെ വിളവ് വർദ്ധിപ്പിക്കൽ എന്നിവയ്ക്ക് ഇൻ വിട്രോ ടിഷ്യു കൾച്ചർ ഫലപ്രദമായ ഒരു രീതിയായി കണക്കാക്കപ്പെടുന്നു [7, 8]. സസ്യവളർച്ചാ നിയന്ത്രണ ഉപകരണങ്ങൾ (PGR-കൾ) രൂപാന്തരീകരണം നിയന്ത്രിക്കുന്നതിൽ നിർണായക പങ്ക് വഹിക്കുന്നു, കൂടാതെ കോളസിന്റെയും മുഴുവൻ ജീവജാലങ്ങളുടെയും ഇൻ വിട്രോ കൃഷിക്ക് അത്യാവശ്യമാണ്. ഈ വികസന പ്രക്രിയകളുടെ വിജയകരമായ പൂർത്തീകരണത്തിന് അവയുടെ സാന്ദ്രതയും സംയോജനവും ഒപ്റ്റിമൈസേഷൻ നിർണായകമാണ് [9]. അതിനാൽ, സെന്റ് ജോൺസ് വോർട്ടിന്റെ (എച്ച്. പെർഫോറാറ്റം) വളർച്ചയും പുനരുൽപ്പാദന ശേഷിയും മെച്ചപ്പെടുത്തുന്നതിന് റെഗുലേറ്ററുകളുടെ ഉചിതമായ ഘടനയും സാന്ദ്രതയും മനസ്സിലാക്കേണ്ടത് പ്രധാനമാണ് [10].
ടിഷ്യു കൾച്ചറിനായി വികസിപ്പിച്ചെടുത്തതോ വികസിപ്പിച്ചുകൊണ്ടിരിക്കുന്നതോ ആയ ഒരു തരം നാനോകണങ്ങളാണ് അയൺ ഓക്സൈഡ് നാനോകണങ്ങൾ (Fe₃O₄). Fe₃O₄ ന് ഗണ്യമായ കാന്തിക ഗുണങ്ങളും, നല്ല ജൈവ പൊരുത്തക്കേടും, സസ്യവളർച്ചയെ പ്രോത്സാഹിപ്പിക്കാനും പാരിസ്ഥിതിക സമ്മർദ്ദം കുറയ്ക്കാനുമുള്ള കഴിവുമുണ്ട്, അതിനാൽ ടിഷ്യു കൾച്ചർ ഡിസൈനുകളിൽ ഇത് ഗണ്യമായ ശ്രദ്ധ ആകർഷിച്ചു. കോശവിഭജനം പ്രോത്സാഹിപ്പിക്കുന്നതിനും, പോഷക ആഗിരണം മെച്ചപ്പെടുത്തുന്നതിനും, ആന്റിഓക്‌സിഡന്റ് എൻസൈമുകൾ സജീവമാക്കുന്നതിനും ഇൻ വിട്രോ കൾച്ചർ ഒപ്റ്റിമൈസ് ചെയ്യുന്നത് ഈ നാനോകണങ്ങളുടെ സാധ്യതയുള്ള പ്രയോഗങ്ങളിൽ ഉൾപ്പെട്ടേക്കാം [11].
സസ്യവളർച്ചയിൽ നല്ല പ്രോത്സാഹന ഫലങ്ങൾ നാനോകണങ്ങൾ കാണിച്ചിട്ടുണ്ടെങ്കിലും, *H. perforatum* ലെ Fe₃O₄ നാനോകണങ്ങളുടെയും ഒപ്റ്റിമൈസ് ചെയ്ത സസ്യവളർച്ച റെഗുലേറ്ററുകളുടെയും സംയോജിത പ്രയോഗത്തെക്കുറിച്ചുള്ള പഠനങ്ങൾ വിരളമായി തുടരുന്നു. ഈ അറിവിന്റെ വിടവ് നികത്താൻ, ഔഷധ സസ്യങ്ങളുടെ സവിശേഷതകൾ മെച്ചപ്പെടുത്തുന്നതിനുള്ള പുതിയ ഉൾക്കാഴ്ചകൾ നൽകുന്നതിനായി ഇൻ വിട്രോ മോർഫോജെനിസിസിലും ദ്വിതീയ മെറ്റാബോലൈറ്റ് ഉൽപാദനത്തിലും അവയുടെ സംയോജിത ഫലങ്ങളുടെ ഫലങ്ങൾ ഈ പഠനം വിലയിരുത്തി. അതിനാൽ, ഈ പഠനത്തിന് രണ്ട് ലക്ഷ്യങ്ങളുണ്ട്: (1) കോളസ് രൂപീകരണം, ചിനപ്പുപൊട്ടൽ പുനരുജ്ജീവിപ്പിക്കൽ, ഇൻ വിട്രോയിൽ വേരൂന്നൽ എന്നിവ ഫലപ്രദമായി പ്രോത്സാഹിപ്പിക്കുന്നതിന് സസ്യവളർച്ച റെഗുലേറ്ററുകളുടെ സാന്ദ്രത ഒപ്റ്റിമൈസ് ചെയ്യുക; (2) ഇൻ വിട്രോയിലെ വളർച്ചാ പാരാമീറ്ററുകളിൽ Fe₃O₄ നാനോകണങ്ങളുടെ ഫലങ്ങൾ വിലയിരുത്തുക. അക്ലിമൈസേഷൻ സമയത്ത് (ഇൻ വിട്രോ) പുനരുജ്ജീവിപ്പിക്കപ്പെട്ട സസ്യങ്ങളുടെ അതിജീവന നിരക്ക് വിലയിരുത്തുന്നത് ഭാവി പദ്ധതികളിൽ ഉൾപ്പെടുന്നു. ഈ പഠനത്തിന്റെ ഫലങ്ങൾ *H. perforatum* ന്റെ സൂക്ഷ്മപ്രചരണ കാര്യക്ഷമതയെ ഗണ്യമായി മെച്ചപ്പെടുത്തുമെന്നും അതുവഴി ഈ പ്രധാനപ്പെട്ട ഔഷധ സസ്യത്തിന്റെ സുസ്ഥിര ഉപയോഗത്തിനും ബയോടെക്നോളജിക്കൽ പ്രയോഗങ്ങൾക്കും സംഭാവന നൽകുമെന്നും പ്രതീക്ഷിക്കുന്നു.
ഈ പഠനത്തിൽ, വയലിൽ വളർത്തുന്ന വാർഷിക സെന്റ് ജോൺസ് വോർട്ട് സസ്യങ്ങളിൽ (മാതൃ സസ്യങ്ങൾ) നിന്ന് ഞങ്ങൾക്ക് ഇല എക്സ്പ്ലാന്റുകൾ ലഭിച്ചു. ഇൻ വിട്രോ കൾച്ചർ സാഹചര്യങ്ങൾ ഒപ്റ്റിമൈസ് ചെയ്യാൻ ഈ എക്സ്പ്ലാന്റുകൾ ഉപയോഗിച്ചു. കൃഷി ചെയ്യുന്നതിന് മുമ്പ്, ഇലകൾ ഒഴുകുന്ന വാറ്റിയെടുത്ത വെള്ളത്തിൽ കുറച്ച് മിനിറ്റ് നന്നായി കഴുകി. തുടർന്ന് എക്സ്പ്ലാൻറ് പ്രതലങ്ങൾ 70% എത്തനോളിൽ 30 സെക്കൻഡ് മുക്കി അണുവിമുക്തമാക്കി, തുടർന്ന് ട്വീൻ 20 ന്റെ ഏതാനും തുള്ളികൾ അടങ്ങിയ 1.5% സോഡിയം ഹൈപ്പോക്ലോറൈറ്റ് (NaOCl) ലായനിയിൽ 10 മിനിറ്റ് മുക്കി. ഒടുവിൽ, അടുത്ത കൾച്ചർ മീഡിയത്തിലേക്ക് മാറ്റുന്നതിന് മുമ്പ് എക്സ്പ്ലാന്റുകൾ അണുവിമുക്തമായ വാറ്റിയെടുത്ത വെള്ളത്തിൽ മൂന്ന് തവണ കഴുകി.
അടുത്ത നാല് ആഴ്ചകളിൽ, മുളകളുടെ പുനരുജ്ജീവന പാരാമീറ്ററുകൾ അളന്നു, അതിൽ പുനരുജ്ജീവന നിരക്ക്, ഓരോ പറിച്ചുനടലിനുമുള്ള മുളകളുടെ എണ്ണം, മുളകളുടെ നീളം എന്നിവ ഉൾപ്പെടുന്നു. പുനരുജ്ജീവിപ്പിച്ച മുളകൾ കുറഞ്ഞത് 2 സെന്റീമീറ്റർ നീളത്തിൽ എത്തുമ്പോൾ, അവയെ പകുതി ശക്തിയുള്ള എംഎസ് മീഡിയം, 0.5 മില്ലിഗ്രാം/ലിറ്റർ ഇൻഡോൾബ്യൂട്ടിക് ആസിഡ് (IBA), 0.3% ഗ്വാർ ഗം എന്നിവ അടങ്ങിയ ഒരു വേരൂന്നൽ മാധ്യമത്തിലേക്ക് മാറ്റി. വേരൂന്നൽ കൾച്ചർ മൂന്ന് ആഴ്ച തുടർന്നു, ഈ സമയത്ത് വേരൂന്നൽ നിരക്ക്, വേരുകളുടെ എണ്ണം, വേരുകളുടെ നീളം എന്നിവ അളന്നു. ഓരോ ചികിത്സയും മൂന്ന് തവണ ആവർത്തിച്ചു, ഓരോ പകർപ്പിലും 10 പറിച്ചുനടലുകൾ കൾച്ചർ ചെയ്തു, ഓരോ ചികിത്സയിലും ഏകദേശം 30 പറിച്ചുനടലുകൾ ലഭിച്ചു.
ചെടിയുടെ ചുവട്ടിൽ നിന്ന് ഏറ്റവും ഉയരമുള്ള ഇലയുടെ അഗ്രം വരെ, ഒരു റൂളർ ഉപയോഗിച്ച്, സെന്റീമീറ്ററിൽ (സെ.മീ) ചെടിയുടെ ഉയരം അളന്നു. തൈകൾ ശ്രദ്ധാപൂർവ്വം നീക്കം ചെയ്ത് വളരുന്ന മാധ്യമം നീക്കം ചെയ്ത ഉടൻ തന്നെ വേരിന്റെ നീളം മില്ലിമീറ്ററിൽ (മില്ലീമീറ്റർ) അളന്നു. ഓരോ ചെടിയിലും മുകുളങ്ങളുടെ എണ്ണം നേരിട്ട് കണക്കാക്കി. നോഡ്യൂളുകൾ എന്നറിയപ്പെടുന്ന ഇലകളിലെ കറുത്ത പാടുകളുടെ എണ്ണം ദൃശ്യപരമായി അളന്നു. ഈ കറുത്ത നോഡ്യൂളുകൾ ഹൈപ്പരിസിൻ അല്ലെങ്കിൽ ഓക്സിഡേറ്റീവ് പാടുകൾ അടങ്ങിയ ഗ്രന്ഥികളാണെന്ന് വിശ്വസിക്കപ്പെടുന്നു, കൂടാതെ ചികിത്സയ്ക്കുള്ള സസ്യത്തിന്റെ പ്രതികരണത്തിന്റെ ഫിസിയോളജിക്കൽ സൂചകമായി ഇവ ഉപയോഗിക്കുന്നു. വളരുന്ന എല്ലാ മാധ്യമവും നീക്കം ചെയ്തതിനുശേഷം, തൈകളുടെ പുതിയ ഭാരം മില്ലിഗ്രാം (mg) കൃത്യതയോടെ ഒരു ഇലക്ട്രോണിക് സ്കെയിൽ ഉപയോഗിച്ച് അളന്നു.
കോളസ് രൂപീകരണ നിരക്ക് കണക്കാക്കുന്നതിനുള്ള രീതി ഇപ്രകാരമാണ്: വിവിധ വളർച്ചാ റെഗുലേറ്ററുകൾ (കൈനാസുകൾ, 2,4-D, Fe3O4) അടങ്ങിയ ഒരു മാധ്യമത്തിൽ നാല് ആഴ്ചത്തേക്ക് എക്സ്പ്ലാന്റുകൾ കൾച്ചർ ചെയ്ത ശേഷം, കോളസ് രൂപപ്പെടുത്താൻ കഴിവുള്ള എക്സ്പ്ലാന്റുകളുടെ എണ്ണം കണക്കാക്കുന്നു. കോളസ് രൂപീകരണ നിരക്ക് കണക്കാക്കുന്നതിനുള്ള സൂത്രവാക്യം ഇപ്രകാരമാണ്:
ഓരോ ചികിത്സയും മൂന്ന് തവണ ആവർത്തിച്ചു, ഓരോ ആവർത്തനത്തിലും കുറഞ്ഞത് 10 എക്സ്പ്ലാന്റുകൾ പരിശോധിച്ചു.
കോളസ് രൂപീകരണ ഘട്ടത്തിനുശേഷം ബഡ് ഡിഫറൻഷ്യേഷൻ പ്രക്രിയ വിജയകരമായി പൂർത്തിയാക്കുന്ന കോളസ് ടിഷ്യുവിന്റെ അനുപാതത്തെയാണ് പുനരുജ്ജീവന നിരക്ക് പ്രതിഫലിപ്പിക്കുന്നത്. വ്യത്യസ്ത ടിഷ്യുവായി രൂപാന്തരപ്പെടാനും പുതിയ സസ്യ അവയവങ്ങളായി വളരാനുമുള്ള കോളസ് ടിഷ്യുവിന്റെ കഴിവ് ഈ സൂചകം പ്രകടമാക്കുന്നു.
വേരൂന്നാൻ കഴിവുള്ള ശാഖകളുടെ എണ്ണവും ആകെ ശാഖകളുടെ എണ്ണവും തമ്മിലുള്ള അനുപാതമാണ് വേരൂന്നൽ ഗുണകം. ഈ സൂചകം വേരൂന്നൽ ഘട്ടത്തിന്റെ വിജയത്തെ പ്രതിഫലിപ്പിക്കുന്നു, ഇത് സൂക്ഷ്മപ്രജനനത്തിലും സസ്യപ്രചരണത്തിലും നിർണായകമാണ്, കാരണം നല്ല വേരൂന്നൽ വളരുന്ന സാഹചര്യങ്ങളിൽ തൈകൾ നന്നായി നിലനിൽക്കാൻ സഹായിക്കുന്നു.
90% മെഥനോൾ ഉപയോഗിച്ച് ഹൈപ്പറിസിൻ സംയുക്തങ്ങൾ വേർതിരിച്ചെടുത്തു. 1 മില്ലി മെഥനോളിൽ അമ്പത് മില്ലിഗ്രാം ഉണങ്ങിയ സസ്യ വസ്തുക്കൾ ചേർത്ത് 30 kHz-ൽ 20 മിനിറ്റ് ഇരുട്ടിൽ മുറിയിലെ താപനിലയിൽ ഒരു അൾട്രാസോണിക് ക്ലീനറിൽ (മോഡൽ A5120-3YJ) സോണിക്കേറ്റ് ചെയ്തു. സോണിക്കേഷനുശേഷം, സാമ്പിൾ 6000 rpm-ൽ 15 മിനിറ്റ് സെൻട്രിഫ്യൂജ് ചെയ്തു. സൂപ്പർനേറ്റന്റ് ശേഖരിച്ചു, കോൺസിസാവോ തുടങ്ങിയവർ വിവരിച്ച രീതി അനുസരിച്ച് പ്ലസ്-3000 S സ്പെക്ട്രോഫോട്ടോമീറ്റർ ഉപയോഗിച്ച് ഹൈപ്പറിസിൻ ആഗിരണം 592 nm-ൽ അളന്നു. [14].
സസ്യവളർച്ചാ നിയന്ത്രണ സാമഗ്രികൾ (PGRs), ഇരുമ്പ് ഓക്സൈഡ് നാനോകണങ്ങൾ (Fe₃O₄-NPs) എന്നിവ ഉപയോഗിച്ചുള്ള മിക്ക ചികിത്സകളും പുനരുജ്ജീവിപ്പിച്ച ചിനപ്പുപൊട്ടൽ ഇലകളിൽ കറുത്ത നോഡ്യൂൾ രൂപപ്പെടാൻ കാരണമായില്ല. 0.5 അല്ലെങ്കിൽ 1 mg/L 2,4-D, 0.5 അല്ലെങ്കിൽ 1 mg/L കൈനെറ്റിൻ, അല്ലെങ്കിൽ 1, 2, അല്ലെങ്കിൽ 4 mg/L ഇരുമ്പ് ഓക്സൈഡ് നാനോകണങ്ങൾ എന്നിവ ഉപയോഗിച്ചുള്ള ചികിത്സകളിൽ നോഡ്യൂളുകൾ ഒന്നും കണ്ടെത്തിയില്ല. കൈനെറ്റിൻ,/അല്ലെങ്കിൽ ഇരുമ്പ് ഓക്സൈഡ് നാനോകണങ്ങൾ എന്നിവയുടെ ഉയർന്ന സാന്ദ്രതയിൽ നോഡ്യൂൾ വികസനത്തിൽ നേരിയ വർദ്ധനവ് (എന്നാൽ സ്ഥിതിവിവരക്കണക്കനുസരിച്ച് പ്രാധാന്യമില്ല) ചില കോമ്പിനേഷനുകൾ കാണിച്ചു, ഉദാഹരണത്തിന് 2,4-D (0.5–2 mg/L) കൈനെറ്റിൻ (1–1.5 mg/L), ഇരുമ്പ് ഓക്സൈഡ് നാനോകണങ്ങൾ (2–4 mg/L) എന്നിവയുമായി സംയോജിപ്പിക്കുമ്പോൾ. ഈ ഫലങ്ങൾ ചിത്രം 2 ൽ കാണിച്ചിരിക്കുന്നു. കറുത്ത നോഡ്യൂളുകൾ ഹൈപ്പറിസിൻ സമ്പുഷ്ടമായ ഗ്രന്ഥികളെ പ്രതിനിധീകരിക്കുന്നു, ഇവ സ്വാഭാവികമായും ഉണ്ടാകുന്നതും ഗുണകരവുമാണ്. ഈ പഠനത്തിൽ, കറുത്ത നോഡ്യൂളുകൾ പ്രധാനമായും ടിഷ്യൂകളുടെ തവിട്ടുനിറവുമായി ബന്ധപ്പെട്ടിരിക്കുന്നു, ഇത് ഹൈപ്പറിസിൻ ശേഖരണത്തിന് അനുകൂലമായ അന്തരീക്ഷത്തെ സൂചിപ്പിക്കുന്നു. 2,4-D, കൈനെറ്റിൻ, Fe₃O₄ നാനോകണങ്ങൾ എന്നിവ ഉപയോഗിച്ചുള്ള ചികിത്സ കാലസ് വളർച്ചയെ പ്രോത്സാഹിപ്പിക്കുകയും, തവിട്ടുനിറം കുറയ്ക്കുകയും, ക്ലോറോഫിൽ ഉള്ളടക്കം വർദ്ധിപ്പിക്കുകയും ചെയ്തു, ഇത് മെച്ചപ്പെട്ട ഉപാപചയ പ്രവർത്തനവും ഓക്സിഡേറ്റീവ് നാശനഷ്ടങ്ങളുടെ സാധ്യത കുറയ്ക്കലും നിർദ്ദേശിക്കുന്നു [37]. സെന്റ് ജോൺസ് വോർട്ട് കാലസിന്റെ വളർച്ചയിലും വികാസത്തിലും 2,4-D, Fe₃O₄ നാനോകണങ്ങളുമായി സംയോജിപ്പിച്ച് കൈനെറ്റിന്റെ ഫലങ്ങൾ ഈ പഠനം വിലയിരുത്തി (ചിത്രം 3a–g). Fe₃O₄ നാനോകണങ്ങൾക്ക് ആന്റിഫംഗൽ, ആന്റിമൈക്രോബയൽ പ്രവർത്തനങ്ങൾ ഉണ്ടെന്നും [38, 39] സസ്യ വളർച്ചാ റെഗുലേറ്ററുകളുമായി സംയോജിച്ച് ഉപയോഗിക്കുമ്പോൾ സസ്യ പ്രതിരോധ സംവിധാനങ്ങളെ ഉത്തേജിപ്പിക്കാനും സെല്ലുലാർ സമ്മർദ്ദ സൂചികകൾ കുറയ്ക്കാനും കഴിയുമെന്നും മുൻ പഠനങ്ങൾ തെളിയിച്ചിട്ടുണ്ട് [18]. ദ്വിതീയ മെറ്റബോളിറ്റുകളുടെ ബയോസിന്തസിസ് ജനിതകമായി നിയന്ത്രിക്കപ്പെടുന്നുണ്ടെങ്കിലും, അവയുടെ യഥാർത്ഥ വിളവ് പാരിസ്ഥിതിക സാഹചര്യങ്ങളെ വളരെയധികം ആശ്രയിച്ചിരിക്കുന്നു. നിർദ്ദിഷ്ട സസ്യ ജീനുകളുടെ പ്രകടനത്തെ നിയന്ത്രിക്കുന്നതിലൂടെയും പാരിസ്ഥിതിക ഘടകങ്ങളോട് പ്രതികരിക്കുന്നതിലൂടെയും ഉപാപചയ, രൂപാന്തര മാറ്റങ്ങൾ ദ്വിതീയ മെറ്റബോളിറ്റ് നിലകളെ സ്വാധീനിക്കും. കൂടാതെ, ഇൻഡ്യൂസറുകൾക്ക് പുതിയ ജീനുകളുടെ സജീവമാക്കൽ പ്രവർത്തനത്തെ പ്രേരിപ്പിക്കാൻ കഴിയും, ഇത് എൻസൈമാറ്റിക് പ്രവർത്തനത്തെ ഉത്തേജിപ്പിക്കുകയും ഒടുവിൽ ഒന്നിലധികം ബയോസിന്തറ്റിക് പാതകളെ സജീവമാക്കുകയും ദ്വിതീയ മെറ്റബോളിറ്റുകളുടെ രൂപീകരണത്തിലേക്ക് നയിക്കുകയും ചെയ്യുന്നു. കൂടാതെ, ഷേഡിംഗ് കുറയ്ക്കുന്നത് സൂര്യപ്രകാശം വർദ്ധിപ്പിക്കുകയും അതുവഴി *ഹൈപ്പറിക്കം പെർഫോറാറ്റം* യുടെ സ്വാഭാവിക ആവാസവ്യവസ്ഥയിൽ പകൽ താപനില വർദ്ധിപ്പിക്കുകയും ചെയ്യുന്നുവെന്ന് മറ്റൊരു പഠനം തെളിയിച്ചു, ഇത് ഹൈപ്പരിസിൻ വിളവ് വർദ്ധിപ്പിക്കുന്നതിനും കാരണമാകുന്നു. ഈ ഡാറ്റയെ അടിസ്ഥാനമാക്കി, ടിഷ്യു കൾച്ചറിൽ സാധ്യതയുള്ള ഇൻഡ്യൂസറുകളായി ഇരുമ്പ് നാനോകണങ്ങളുടെ പങ്കിനെക്കുറിച്ച് ഈ പഠനം അന്വേഷിച്ചു. എൻസൈമാറ്റിക് ഉത്തേജനം വഴി ഹെസ്പെരിഡിൻ ബയോസിന്തസിസിൽ ഉൾപ്പെട്ടിരിക്കുന്ന ജീനുകളെ ഈ നാനോകണങ്ങൾക്ക് സജീവമാക്കാൻ കഴിയുമെന്ന് ഫലങ്ങൾ കാണിച്ചു, ഇത് ഈ സംയുക്തത്തിന്റെ ശേഖരണം വർദ്ധിപ്പിക്കുന്നതിലേക്ക് നയിക്കുന്നു (ചിത്രം 2). അതിനാൽ, സ്വാഭാവിക സാഹചര്യങ്ങളിൽ വളരുന്ന സസ്യങ്ങളുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ, മിതമായ സമ്മർദ്ദം ദ്വിതീയ മെറ്റബോളിറ്റുകളുടെ ബയോസിന്തസിസിൽ ഉൾപ്പെട്ടിരിക്കുന്ന ജീനുകളുടെ സജീവമാക്കലുമായി സംയോജിപ്പിക്കുമ്പോൾ വിവോയിൽ അത്തരം സംയുക്തങ്ങളുടെ ഉത്പാദനം വർദ്ധിപ്പിക്കാൻ കഴിയുമെന്ന് വാദിക്കാം. കോമ്പിനേഷൻ ചികിത്സകൾ സാധാരണയായി പുനരുജ്ജീവന നിരക്കിൽ ഒരു നല്ല സ്വാധീനം ചെലുത്തുന്നു, എന്നാൽ ചില സന്ദർഭങ്ങളിൽ, ഈ പ്രഭാവം ദുർബലമാകുന്നു. ശ്രദ്ധേയമായി, 1 mg/L 2,4-D, 1.5 mg/L കൈനസ്, വ്യത്യസ്ത സാന്ദ്രതകൾ എന്നിവ ഉപയോഗിച്ചുള്ള ചികിത്സ കൺട്രോൾ ഗ്രൂപ്പുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ പുനരുജ്ജീവന നിരക്ക് സ്വതന്ത്രമായും ഗണ്യമായും 50.85% വർദ്ധിപ്പിക്കും (ചിത്രം 4c). നാനോഹോർമോണുകളുടെ പ്രത്യേക സംയോജനങ്ങൾ സസ്യവളർച്ചയെയും മെറ്റബോളൈറ്റ് ഉൽപാദനത്തെയും പ്രോത്സാഹിപ്പിക്കുന്നതിന് സിനർജിസ്റ്റിക്കലായി പ്രവർത്തിക്കുമെന്ന് ഈ ഫലങ്ങൾ സൂചിപ്പിക്കുന്നു, ഇത് ഔഷധ സസ്യങ്ങളുടെ ടിഷ്യു കൾച്ചറിന് വലിയ പ്രാധാന്യമുള്ളതാണ്. 2,4-D ചികിത്സയ്ക്ക് സെന്റ് പെർഫോററ്റത്തിൽ സ്വതന്ത്രമായി കോളസ് രൂപീകരണത്തിന് കാരണമാകുമെന്ന് പാമറും കെല്ലറും [50] കാണിച്ചു, അതേസമയം കൈനസ് ചേർക്കുന്നത് കോളസ് രൂപീകരണവും പുനരുജ്ജീവനവും ഗണ്യമായി വർദ്ധിപ്പിച്ചു. ഹോർമോൺ ബാലൻസ് മെച്ചപ്പെടുത്തുന്നതും കോശവിഭജനത്തിന്റെ ഉത്തേജനവുമാണ് ഈ പ്രഭാവം ഉണ്ടാക്കിയത്. Fe₃O₄-NP ചികിത്സയ്ക്ക് ആന്റിഓക്‌സിഡന്റ് എൻസൈമുകളുടെ പ്രവർത്തനം സ്വതന്ത്രമായി വർദ്ധിപ്പിക്കാനും അതുവഴി സെന്റ് പെർഫോററ്റത്തിൽ വേരുകളുടെ വളർച്ചയെ പ്രോത്സാഹിപ്പിക്കാനും കഴിയുമെന്ന് ബാൽ തുടങ്ങിയവർ [51] കണ്ടെത്തി. 0.5 mg/L, 1 mg/L, 1.5 mg/L സാന്ദ്രതകളിൽ Fe₃O₄ നാനോകണങ്ങൾ അടങ്ങിയ കൾച്ചർ മീഡിയ ഫ്ളാക്സ് സസ്യങ്ങളുടെ പുനരുജ്ജീവന നിരക്ക് മെച്ചപ്പെടുത്തി [52]. കൈനെറ്റിൻ, 2,4-ഡൈക്ലോറോബെൻസോത്തിയാസോലിനോൺ, Fe₃O₄ നാനോകണങ്ങൾ എന്നിവയുടെ ഉപയോഗം കോളസ്, വേര് രൂപീകരണ നിരക്കുകൾ ഗണ്യമായി മെച്ചപ്പെടുത്തി, എന്നിരുന്നാലും, ഇൻ വിട്രോ പുനരുജ്ജീവനത്തിനായി ഈ ഹോർമോണുകൾ ഉപയോഗിക്കുന്നതിന്റെ സാധ്യതയുള്ള പാർശ്വഫലങ്ങൾ പരിഗണിക്കേണ്ടതുണ്ട്. ഉദാഹരണത്തിന്, 2,4-ഡൈക്ലോറോബെൻസോത്തിയാസോലിനോൺ അല്ലെങ്കിൽ കൈനെറ്റിന്റെ ദീർഘകാല അല്ലെങ്കിൽ ഉയർന്ന സാന്ദ്രത ഉപയോഗം സോമാറ്റിക് ക്ലോണൽ വ്യതിയാനം, ഓക്സിഡേറ്റീവ് സ്ട്രെസ്, അസാധാരണമായ കോളസ് രൂപഘടന അല്ലെങ്കിൽ വിട്രിഫിക്കേഷന് കാരണമാകാം. അതിനാൽ, ഉയർന്ന പുനരുജ്ജീവന നിരക്ക് ജനിതക സ്ഥിരത പ്രവചിക്കണമെന്നില്ല. എല്ലാ പുനരുജ്ജീവിപ്പിക്കപ്പെട്ട സസ്യങ്ങളെയും തന്മാത്രാ മാർക്കറുകൾ (ഉദാ: RAPD, ISSR, AFLP) അല്ലെങ്കിൽ സൈറ്റോജെനെറ്റിക് വിശകലനം ഉപയോഗിച്ച് വിലയിരുത്തി ഇൻ വിവോ സസ്യങ്ങളുമായുള്ള അവയുടെ ഏകത, സാമ്യം എന്നിവ നിർണ്ണയിക്കണം [53,54,55].
*ഹൈപ്പറിക്കം പെർഫൊറാറ്റത്തിൽ* സസ്യവളർച്ചാ റെഗുലേറ്ററുകളുടെ (2,4-D, കൈനെറ്റിൻ) സംയുക്ത ഉപയോഗം Fe₃O₄ നാനോപാർട്ടിക്കിളുകളുടെ സംയുക്ത ഉപയോഗം രൂപാന്തരീകരണവും പ്രധാന ബയോആക്ടീവ് മെറ്റബോളിറ്റുകളുടെ (ഹൈപ്പറിക്സിൻ, ഹൈപ്പറോസൈഡ് ഉൾപ്പെടെ) ശേഖരണവും വർദ്ധിപ്പിക്കുമെന്ന് ഈ പഠനം ആദ്യമായി തെളിയിച്ചു. ഒപ്റ്റിമൈസ് ചെയ്ത ചികിത്സാ രീതി (1 mg/L 2,4-D + 1 mg/L കൈനെറ്റിൻ + 4 mg/L Fe₃O₄-NPs) കോളസ് രൂപീകരണം, ഓർഗാനോജെനിസിസ്, ദ്വിതീയ മെറ്റബോളൈറ്റ് വിളവ് എന്നിവ പരമാവധിയാക്കുക മാത്രമല്ല, നേരിയ പ്രേരക ഫലവും പ്രകടമാക്കി, ഇത് സസ്യത്തിന്റെ സമ്മർദ്ദ സഹിഷ്ണുതയും ഔഷധ മൂല്യവും മെച്ചപ്പെടുത്താൻ സാധ്യതയുണ്ട്. നാനോ ടെക്നോളജിയുടെയും സസ്യ ടിഷ്യു കൾച്ചറിന്റെയും സംയോജനം ഔഷധ സംയുക്തങ്ങളുടെ വലിയ തോതിലുള്ള ഇൻ വിട്രോ ഉൽപാദനത്തിന് സുസ്ഥിരവും കാര്യക്ഷമവുമായ ഒരു പ്ലാറ്റ്‌ഫോം നൽകുന്നു. ഈ ഫലങ്ങൾ വ്യാവസായിക ആപ്ലിക്കേഷനുകൾക്കും തന്മാത്രാ സംവിധാനങ്ങൾ, ഡോസേജ് ഒപ്റ്റിമൈസേഷൻ, ജനിതക കൃത്യത എന്നിവയെക്കുറിച്ചുള്ള ഭാവി ഗവേഷണത്തിനും വഴിയൊരുക്കുന്നു, അതുവഴി ഔഷധ സസ്യങ്ങളെക്കുറിച്ചുള്ള അടിസ്ഥാന ഗവേഷണത്തെ പ്രായോഗിക ബയോടെക്നോളജിയുമായി ബന്ധിപ്പിക്കുന്നു.