ആന്തെൽമിന്റിക് മരുന്ന് N,N-ഡൈതൈൽ-എം-ടോളുഅമൈഡ് (ഡീറ്റ്) ACHE (അസറ്റൈൽകോളിനെസ്റ്ററേസ്) തടയുന്നതായി റിപ്പോർട്ട് ചെയ്യപ്പെട്ടിട്ടുണ്ട്, കൂടാതെ അമിതമായ വാസ്കുലറൈസേഷൻ കാരണം അർബുദ സാധ്യതയുള്ള ഗുണങ്ങളുമുണ്ട്. ഈ പ്രബന്ധത്തിൽ, DEET ആൻജിയോജെനിസിസിനെ പ്രോത്സാഹിപ്പിക്കുന്ന എൻഡോതെലിയൽ കോശങ്ങളെ പ്രത്യേകമായി ഉത്തേജിപ്പിക്കുകയും അതുവഴി ട്യൂമർ വളർച്ച വർദ്ധിപ്പിക്കുകയും ചെയ്യുന്നുവെന്ന് ഞങ്ങൾ കാണിക്കുന്നു. DEET ആൻജിയോജെനിസിസിലേക്ക് നയിക്കുന്ന സെല്ലുലാർ പ്രക്രിയകളെ സജീവമാക്കുന്നു, ഇതിൽ വ്യാപനം, മൈഗ്രേഷൻ, അഡീഷൻ എന്നിവ ഉൾപ്പെടുന്നു. ഇത് എൻഡോതെലിയൽ കോശങ്ങളിൽ വർദ്ധിച്ച NO ഉൽപ്പാദനവും VEGF എക്സ്പ്രഷനുമായി ബന്ധപ്പെട്ടിരിക്കുന്നു. M3 നിശബ്ദമാക്കുകയോ ഫാർമക്കോളജിക്കൽ M3 ഇൻഹിബിറ്ററുകൾ ഉപയോഗിക്കുകയോ ചെയ്യുന്നത് ഈ ഫലങ്ങളെല്ലാം ഇല്ലാതാക്കി, DEET-ഇൻഡ്യൂസ്ഡ് ആൻജിയോജെനിസിസ് M3-സെൻസിറ്റീവ് ആണെന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു. M3 റിസപ്റ്ററുകളെ അമിതമായി എക്സ്പ്രസ് ചെയ്യുന്ന എൻഡോതെലിയൽ, HEK കോശങ്ങളിൽ കാൽസ്യം സിഗ്നലിംഗ് ഉൾപ്പെടുന്ന പരീക്ഷണങ്ങളും ബൈൻഡിംഗ്, ഡോക്കിംഗ് പഠനങ്ങളും സൂചിപ്പിക്കുന്നത് DEET M3 റിസപ്റ്ററുകളുടെ ഒരു അലോസ്റ്റെറിക് മോഡുലേറ്ററായി പ്രവർത്തിക്കുന്നു എന്നാണ്. കൂടാതെ, DEET ACHE നെ തടയുന്നു, അതുവഴി അസറ്റൈൽകോളിന്റെ ജൈവ ലഭ്യതയും M3 റിസപ്റ്ററുകളുമായി ബന്ധിപ്പിക്കുന്നതും അലോസ്റ്റെറിക് നിയന്ത്രണത്തിലൂടെ പ്രോആൻജിയോജെനിക് ഇഫക്റ്റുകൾ വർദ്ധിപ്പിക്കുന്നതും ആണ്.
സ്വിസ് എലികളുടെ അയോർട്ടയിൽ നിന്ന് പ്രാഥമിക ഇസികളെ വേർതിരിച്ചെടുത്തു. കൊബയാഷി പ്രോട്ടോക്കോൾ 26 ൽ നിന്ന് വേർതിരിച്ചെടുക്കൽ രീതി സ്വീകരിച്ചു. നാലാമത്തെ പാസേജ് വരെ 5% ചൂട്-നിർജ്ജീവമാക്കിയ എഫ്ബിഎസ് ഉപയോഗിച്ച് ഇബിഎം-2 മീഡിയത്തിലാണ് മുറൈൻ ഇസികൾ കൾച്ചർ ചെയ്തത്.
HUVEC, U87MG, അല്ലെങ്കിൽ BF16F10 എന്നിവയുടെ വ്യാപനത്തിൽ DEET യുടെ രണ്ട് സാന്ദ്രതകളുടെ സ്വാധീനം CyQUANT സെൽ പ്രൊലിഫറേഷൻ അസ്സേ കിറ്റ് (മോളിക്യുലാർ പ്രോബ്സ്, C7026) ഉപയോഗിച്ച് വിശകലനം ചെയ്തു. ചുരുക്കത്തിൽ, 96 കിണർ പ്ലേറ്റിൽ ഓരോ കിണറിലും 5.103 കോശങ്ങൾ വീതം വിത്ത് പാകി, രാത്രി മുഴുവൻ ഘടിപ്പിക്കാൻ അനുവദിച്ചു, തുടർന്ന് 24 മണിക്കൂർ DEET ഉപയോഗിച്ച് ചികിത്സിച്ചു. വളർച്ചാ മാധ്യമം നീക്കം ചെയ്തതിനുശേഷം, മൈക്രോപ്ലേറ്റിന്റെ ഓരോ കിണറിലും ഡൈ ബൈൻഡിംഗ് ലായനി ചേർത്ത് 30 മിനിറ്റ് 37 °C താപനിലയിൽ കോശങ്ങളെ ഇൻകുബേറ്റ് ചെയ്യുക. 485 nm എക്‌സൈറ്റേഷൻ ഫിൽട്ടറുകളും 530 nm എമിഷൻ ഫിൽട്ടറുകളും സജ്ജീകരിച്ച മിത്രാസ് LB940 മൾട്ടിമോഡ് മൈക്രോപ്ലേറ്റ് റീഡർ (ബെർത്തോൾഡ് ടെക്നോളജീസ്, ബാഡ് വൈൽഡ്ബാഡ്, ജർമ്മനി) ഉപയോഗിച്ചാണ് ഫ്ലൂറസെൻസ് ലെവലുകൾ നിർണ്ണയിച്ചത്.
96 കിണർ പ്ലേറ്റുകളിൽ ഓരോ കിണറിനും 104 കോശങ്ങൾ എന്ന സാന്ദ്രതയിൽ HUVEC വിത്തുപാകി. 24 മണിക്കൂർ DEET ഉപയോഗിച്ച് കോശങ്ങളെ ചികിത്സിച്ചു. കളറിമെട്രിക് MTT അസ്സേ (സിഗ്മ-ആൽഡ്രിച്ച്, M5655) ഉപയോഗിച്ച് കോശ പ്രവർത്തനക്ഷമത വിലയിരുത്തി. 570 nm തരംഗദൈർഘ്യമുള്ള ഒരു മൾട്ടിമോഡ് മൈക്രോപ്ലേറ്റ് റീഡറിൽ (മിത്രാസ് LB940) ഒപ്റ്റിക്കൽ സാന്ദ്രത മൂല്യങ്ങൾ ലഭിച്ചു.
ഇൻ വിട്രോ ആൻജിയോജെനിസിസ് അസ്സേകൾ ഉപയോഗിച്ച് DEET യുടെ ഫലങ്ങൾ പഠിച്ചു. 10-8 M അല്ലെങ്കിൽ 10-5 M DEET ഉപയോഗിച്ചുള്ള ചികിത്സ HUVEC-കളിൽ കാപ്പിലറി നീളത്തിന്റെ രൂപീകരണം വർദ്ധിപ്പിച്ചു (ചിത്രം 1a, b, വെളുത്ത ബാറുകൾ). നിയന്ത്രണ ഗ്രൂപ്പുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ, 10-14 മുതൽ 10-5 M വരെയുള്ള DEET സാന്ദ്രതകളുള്ള ചികിത്സ, കാപ്പിലറി നീളം 10-8 M DEET-ൽ ഒരു പീഠഭൂമിയിലെത്തിയതായി കാണിച്ചു (അനുബന്ധ ചിത്രം S2). 10-8 M, 10-5 M എന്നീ സാന്ദ്രത പരിധിയിൽ DEET ഉപയോഗിച്ച് ചികിത്സിച്ച HUVEC-കളുടെ ഇൻ വിട്രോ പ്രോആൻജിയോജെനിക് ഫലത്തിൽ കാര്യമായ വ്യത്യാസമൊന്നും കണ്ടെത്തിയില്ല.
നിയോവാസ്കുലറൈസേഷനിൽ DEET യുടെ സ്വാധീനം നിർണ്ണയിക്കാൻ, ഞങ്ങൾ ഇൻ വിവോ നിയോവാസ്കുലറൈസേഷൻ പഠനങ്ങൾ നടത്തി. 14 ദിവസത്തിനുശേഷം, 10-8 M അല്ലെങ്കിൽ 10-5 M DEET ഉപയോഗിച്ച് പ്രീകൾച്ചർ ചെയ്ത എൻഡോതെലിയൽ കോശങ്ങൾ കുത്തിവച്ച എലികളിൽ ഹീമോഗ്ലോബിൻ ഉള്ളടക്കത്തിൽ ഗണ്യമായ വർദ്ധനവ് കാണിച്ചു (ചിത്രം 1c, വെളുത്ത ബാറുകൾ).
കൂടാതെ, DEET-ഇൻഡ്യൂസ്ഡ് നിയോവാസ്കുലറൈസേഷൻ U87MG സെനോഗ്രാഫ്റ്റ് വഹിക്കുന്ന എലികളിൽ പഠിച്ചു, 10-5 M എന്ന അളവിൽ DEET ഉപയോഗിച്ച് ദിവസേന കുത്തിവയ്ക്കപ്പെട്ടു, ഇത് തുറന്നുകാണിക്കപ്പെട്ട മനുഷ്യരിൽ സാധാരണമാണ്. 23 ൽ. U87MG കോശങ്ങൾ എലികളിലേക്ക് കുത്തിവച്ചതിന് 14 ദിവസത്തിന് ശേഷം കണ്ടെത്താവുന്ന മുഴകൾ (അതായത് ട്യൂമറുകൾ > 100 mm3) നിരീക്ഷിക്കപ്പെട്ടു. 28-ാം ദിവസം, കൺട്രോൾ എലികളുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ DEET-ചികിത്സിച്ച എലികളിൽ ട്യൂമർ വളർച്ച ഗണ്യമായി വർദ്ധിച്ചു (ചിത്രം 1d, ചതുരങ്ങൾ). കൂടാതെ, ട്യൂമറുകളുടെ CD31 സ്റ്റെയിനിംഗ് കാണിക്കുന്നത് DEET കാപ്പിലറി ഏരിയ ഗണ്യമായി വർദ്ധിപ്പിച്ചു, പക്ഷേ മൈക്രോവെസ്സൽ സാന്ദ്രത വർദ്ധിപ്പിച്ചില്ല എന്നാണ്. (ചിത്രം 1e-g).
DETA-ഇൻഡ്യൂസ്ഡ് പ്രോലിഫറേഷനിൽ മസ്കറിനിക് റിസപ്റ്ററുകളുടെ പങ്ക് നിർണ്ണയിക്കാൻ, pFHHSiD (10-7 M, ഒരു സെലക്ടീവ് M3 റിസപ്റ്റർ എതിരാളി) യുടെ സാന്നിധ്യത്തിൽ 10-8 M അല്ലെങ്കിൽ 10-5 M DETA ഉപയോഗിച്ചു. HUVEC. pFHHSiD യുടെ ചികിത്സ എല്ലാ സാന്ദ്രതകളിലും DETA യുടെ പ്രൊലിഫറേറ്റീവ് ഗുണങ്ങളെ പൂർണ്ണമായും തടഞ്ഞു (പട്ടിക 1).
ഈ സാഹചര്യങ്ങളിൽ, DEET HUVEC കോശങ്ങളിലെ കാപ്പിലറി നീളം വർദ്ധിപ്പിക്കുമോ എന്നും ഞങ്ങൾ പരിശോധിച്ചു. അതുപോലെ, pFHHSiD DEET-ഇൻഡ്യൂസ്ഡ് കാപ്പിലറി നീളത്തെ ഗണ്യമായി തടഞ്ഞു (ചിത്രം 1a, b, ഗ്രേ ബാറുകൾ). കൂടാതെ, M3 siRNA ഉപയോഗിച്ചും സമാനമായ പരീക്ഷണങ്ങൾ നടത്തി. കാപ്പിലറി രൂപീകരണം പ്രോത്സാഹിപ്പിക്കുന്നതിൽ നിയന്ത്രണ siRNA ഫലപ്രദമല്ലെങ്കിലും, M3 മസ്കറിനിക് റിസപ്റ്ററിന്റെ നിശബ്ദത കാപ്പിലറി നീളം വർദ്ധിപ്പിക്കാനുള്ള DEET യുടെ കഴിവ് ഇല്ലാതാക്കി (ചിത്രം 1a, b, കറുത്ത ബാറുകൾ).
കൂടാതെ, 10-8 M അല്ലെങ്കിൽ 10-5 M DEET-ഇൻഡ്യൂസ്ഡ് വാസ്കുലറൈസേഷൻ ഇൻ വിട്രോയും നിയോവാസ്കുലറൈസേഷൻ ഇൻ വിവോയും pFHHSiD പൂർണ്ണമായും തടഞ്ഞു (ചിത്രം 1c, d, സർക്കിളുകൾ). സെലക്ടീവ് M3 റിസപ്റ്റർ എതിരാളികളോടോ M3 siRNAയോടോ സംവേദനക്ഷമതയുള്ള ഒരു പാതയിലൂടെ DEET ആൻജിയോജെനിസിസിനെ പ്രോത്സാഹിപ്പിക്കുന്നുവെന്ന് ഈ ഫലങ്ങൾ സൂചിപ്പിക്കുന്നു.
DEET യുടെ തന്മാത്രാ ലക്ഷ്യം ACHE ആണ്. ACHE ഇൻഹിബിറ്ററുകളായി പ്രവർത്തിക്കുന്ന ഡോൺപെസിൽ പോലുള്ള മരുന്നുകൾക്ക് ഇൻ വിട്രോയിലും മൗസ് ഹിൻഡ്‌ലിംബ് ഇസ്കെമിയ മോഡലുകളിലും EC ആൻജിയോജെനിസിസിനെ ഉത്തേജിപ്പിക്കാൻ കഴിയും14. HUVEC-യിലെ ACHE എൻസൈം പ്രവർത്തനത്തിൽ DEET യുടെ രണ്ട് സാന്ദ്രതകളുടെ പ്രഭാവം ഞങ്ങൾ പരീക്ഷിച്ചു. നിയന്ത്രണ സാഹചര്യങ്ങളുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ DEET യുടെ കുറഞ്ഞ (10-8 M) ഉം ഉയർന്ന (10-5 M) സാന്ദ്രതയും എൻഡോതെലിയൽ ACHE പ്രവർത്തനം കുറഞ്ഞു (ചിത്രം 2).
DEET യുടെ രണ്ട് സാന്ദ്രതകളും (10-8 M ഉം 10-5 M ഉം) HUVEC-യിലെ അസറ്റൈൽകോളിനെസ്റ്ററേസ് പ്രവർത്തനം കുറച്ചു. അസറ്റൈൽകോളിനെസ്റ്ററേസ് ഇൻഹിബിറ്ററുകൾക്കുള്ള നിയന്ത്രണമായി BW284c51 (10-5 M) ഉപയോഗിച്ചു. വാഹന ചികിത്സിക്കുന്ന കോശങ്ങളുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ DEET യുടെ രണ്ട് സാന്ദ്രതകളുമായി ചികിത്സിക്കപ്പെടുന്ന HUVEC-യിലെ ACHE പ്രവർത്തനത്തിന്റെ ശതമാനമായി ഫലങ്ങൾ പ്രകടിപ്പിക്കുന്നു. ആറ് സ്വതന്ത്ര പരീക്ഷണങ്ങളുടെ ശരാശരി ± SEM ആയി മൂല്യങ്ങൾ പ്രകടിപ്പിക്കുന്നു. *p < 0.05 നിയന്ത്രണവുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ (ക്രൂസ്കൽ-വാലിസ്, ഡൺ മൾട്ടിപ്പിൾ താരതമ്യ പരിശോധന).
ആൻജിയോജനിക് പ്രക്രിയയിൽ നൈട്രിക് ഓക്സൈഡ് (NO) ഉൾപ്പെട്ടിരിക്കുന്നു 33, അതിനാൽ, DEET-ഉത്തേജിത HUVEC-കളിൽ NO ഉൽപ്പാദനം പഠിച്ചു. നിയന്ത്രണ കോശങ്ങളുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ DEET-ചികിത്സിച്ച എൻഡോതെലിയൽ NO ഉൽപ്പാദനം വർദ്ധിച്ചു, പക്ഷേ 10-8 M എന്ന അളവിൽ മാത്രമേ പ്രാധാന്യത്തിലെത്തിയുള്ളൂ (ചിത്രം 3c). DEET-ഇൻഡ്യൂസ്ഡ് NO ഉൽപ്പാദനത്തെ നിയന്ത്രിക്കുന്ന തന്മാത്രാ മാറ്റങ്ങൾ നിർണ്ണയിക്കാൻ, വെസ്റ്റേൺ ബ്ലോട്ടിംഗ് വഴി eNOS എക്സ്പ്രഷനും ആക്റ്റിവേഷനും വിശകലനം ചെയ്തു. DEET ചികിത്സ eNOS എക്സ്പ്രഷനിൽ മാറ്റം വരുത്തിയില്ലെങ്കിലും, eNOS ഫോസ്ഫോറിലേഷനിലെ ചികിത്സിക്കാത്ത കോശങ്ങളുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ അതിന്റെ സജീവമാക്കൽ സൈറ്റിൽ (Ser-1177) eNOS ഫോസ്ഫോറിലേഷൻ ഗണ്യമായി വർദ്ധിപ്പിച്ചു (ചിത്രം 3d). കൂടാതെ, ഫോസ്ഫോറിലേറ്റഡ് eNOS ന്റെ അളവ് എൻസൈമിന്റെ ആകെ അളവിലേക്ക് സാധാരണ നിലയിലാക്കിയതിനുശേഷം ആക്റ്റിവേഷൻ സൈറ്റിലും ഇൻഹിബിറ്ററി സൈറ്റിലും ഫോസ്ഫോറിലേറ്റഡ് eNOS ന്റെ അനുപാതം കണക്കാക്കി. ചികിത്സയില്ലാത്ത കോശങ്ങളുമായി താരതമ്യപ്പെടുത്തുമ്പോൾ DEET യുടെ ഓരോ സാന്ദ്രതയും ഉപയോഗിച്ച് ചികിത്സിക്കുന്ന HUVEC-കളിൽ ഈ അനുപാതം ഗണ്യമായി വർദ്ധിച്ചു (ചിത്രം 3d).
ഒടുവിൽ, പ്രധാന പ്രോആൻജിയോജനിക് ഘടകങ്ങളിൽ ഒന്നായ VEGF ന്റെ എക്സ്പ്രഷൻ വെസ്റ്റേൺ ബ്ലോട്ടിംഗ് ഉപയോഗിച്ച് വിശകലനം ചെയ്തു. DEET VEGF എക്സ്പ്രഷനെ ഗണ്യമായി വർദ്ധിപ്പിച്ചു, അതേസമയം pFHHSiD ഈ എക്സ്പ്രഷനെ പൂർണ്ണമായും തടഞ്ഞു.
DEET യുടെ ഫലങ്ങൾ ഫാർമക്കോളജിക്കൽ ബ്ലോക്കേഡിനും M3 റിസപ്റ്ററുകളുടെ ഡൌൺറെഗുലേഷനും സെൻസിറ്റീവ് ആയതിനാൽ, DEET കാൽസ്യം സിഗ്നലിംഗ് വർദ്ധിപ്പിക്കുമെന്ന സിദ്ധാന്തം ഞങ്ങൾ പരീക്ഷിച്ചു. അതിശയകരമെന്നു പറയട്ടെ, ഉപയോഗിച്ച രണ്ട് സാന്ദ്രതകൾക്കും HUVEC (ഡാറ്റ കാണിച്ചിട്ടില്ല) യിലും HEK/M3 (ചിത്രം 4a, b) ലും സൈറ്റോപ്ലാസ്മിക് കാൽസ്യം വർദ്ധിപ്പിക്കുന്നതിൽ DEET പരാജയപ്പെട്ടു.
പോസ്റ്റ് സമയം: ഡിസംബർ-30-2024